薛氏丙酸桿菌產(chǎn)抑菌性代謝物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

潘 淼,付雅欣,洪 楓,楊雪霞,*,高紅亮

(1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620;2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062)

薛氏丙酸桿菌產(chǎn)抑菌性代謝物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

潘 淼1,付雅欣1,洪 楓1,楊雪霞1,*,高紅亮2

(1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院,上海 201620;2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062)

本文利用單因子實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對薛氏丙酸桿菌產(chǎn)抑菌性代謝物的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化,以降低培養(yǎng)基成本和進(jìn)一步提高代謝物抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,玉米漿和大豆蛋白胨可以代替原始培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨,通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到了薛氏丙酸桿菌產(chǎn)抑菌性代謝物的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖8.2g/L,大豆蛋白胨5.1g/L,玉米漿12.7g/L,在此條件下,代謝物抑菌活性的理論值為29.5AU/mL,實(shí)際測定值為29.4AU/mL。優(yōu)化之后,薛氏丙酸桿菌代謝物抑菌性提高了57.2%,培養(yǎng)基成本大大降低。

丙酸桿菌,抑菌性代謝物,培養(yǎng)基優(yōu)化,響應(yīng)面設(shè)計(jì)

乳品丙酸桿菌是來自發(fā)酵食品中的一類丙酸桿菌[1],其生長代謝過程中產(chǎn)生多種抑菌性代謝物,如丙酸、乙酸等有機(jī)酸和細(xì)菌素等。這些抑菌性代謝物能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母等[2-3]。作為食品來源的微生物,乳品丙酸桿菌被認(rèn)為是安全的微生物[4],利用其抑菌性代謝物生產(chǎn)食品防腐劑代替化學(xué)防腐劑有很大的優(yōu)勢,日益受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注[5-7]。法國羅地亞公司利用謝氏丙酸桿菌的代謝物開發(fā)了一種新型生物防腐劑MicrogardTM,已被美國醫(yī)藥和食品管理局(FDA)批準(zhǔn)可用于食品中。國內(nèi)學(xué)者也注意到丙酸桿菌抑菌性代謝物的價(jià)值,并進(jìn)行相關(guān)菌株的選育、發(fā)酵條件優(yōu)化等研究[8-11]。

利用丙酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生抑菌性代謝物時(shí),丙酸桿菌培養(yǎng)基的組成不僅影響代謝物抑菌活性,而且影響生產(chǎn)成本。目前丙酸桿菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的成分主要為葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物。胰蛋白胨和酵母提取物作為工業(yè)發(fā)酵用培養(yǎng)基成分時(shí)存在價(jià)格較高的問題,因此有必要研究價(jià)格相對低廉的工業(yè)用培養(yǎng)基成分。另外,丙酸桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性也受培養(yǎng)基成分影響[9]。為提高抑菌性代謝物活性和降低發(fā)酵生產(chǎn)成本,篩選適合工業(yè)發(fā)酵用的培養(yǎng)基是非常必要的。本論文以一種能產(chǎn)生抑菌代謝物的薛氏丙酸桿菌為對象,選擇工業(yè)用培養(yǎng)基成分,通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-behnken響應(yīng)面分析法對薛氏丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和配比進(jìn)行優(yōu)化,以期為丙酸桿菌抑菌性代謝物工業(yè)化生產(chǎn)提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薛氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichiisubspshermanii),本實(shí)驗(yàn)室保存。惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida1.2309),中科院微生物所購買。玉米漿干粉(山東鄆城康源生物科技有限公司),植物水解蛋白:HVP-FSA(水解大豆蛋白)、HVP-FSC(水解大豆蛋白)(保定新味康食品配料有限公司),植物水解蛋白HVP-AK(水解玉米蛋白)、EVP-AA(水解大豆蛋白)、HVP-AG(水解小麥蛋白)、HVP-B(水解大豆蛋白)(保定味群食品科技股份有限公司),小麥水解蛋白(江蘇麥凱樂生物科技有限公司),魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨(國藥集團(tuán))。酵母提取物(安琪酵母股份有限公司)。丙酸桿菌種子培養(yǎng)基為SLB培養(yǎng)基[12]。發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L,葡萄糖10g/L,pH6.5～7.0,115℃滅菌30min。指示菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。軟瓊脂培養(yǎng)基是在原液體培養(yǎng)基中加入0.75%的瓊脂,固體培養(yǎng)基是在原液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

SW-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺(tái) 上海一恒科技有限公司;YXQ-LS-SII型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)廠;9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HYG-B型培英全溫度控制搖瓶柜 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機(jī) 艾本德(effendorf)公司;BS 224型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 丙酸桿菌的培養(yǎng):取保藏于甘油凍存管中的丙酸桿菌菌種,按1%接種量接到SLB培養(yǎng)基中,在具蓋三角瓶中30℃靜置培養(yǎng)48h,即可用做種子。按3%的接種量接入活化的丙酸桿菌種子于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的具蓋三角瓶中,30℃靜置培養(yǎng),每隔24h將三角瓶置于磁力攪拌器上攪拌10min,避免菌體沉積底部。

指示菌的培養(yǎng):從斜面上取1環(huán)惡臭假單胞菌,接入裝有50mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中,于30℃,160r/min搖床培養(yǎng)12h。

1.2.2 丙酸桿菌代謝物抑菌性的測定

1.2.2.1 丙酸桿菌代謝物的制備 培養(yǎng)5d的丙酸桿菌發(fā)酵液于8000r/min、4℃離心10min,收集上清液,用0.22μm水系濾膜過濾,所得濾液即為丙酸桿菌代謝物粗提液。用1mol/L的NaOH和0.5mol/L的檸檬酸將丙酸桿菌代謝物粗提取液pH調(diào)至5.3備用。

1.2.2.2 丙酸桿菌代謝物抑菌性的測定 雙層瓊脂擴(kuò)散法[13]:將6mL混有指示菌的軟瓊脂培養(yǎng)基覆蓋在素瓊脂上。待凝固后,用內(nèi)徑7mm的不銹鋼打孔器打孔,每孔注入150μL丙酸桿菌代謝物。將平板于4℃冰箱中放置5h,使丙酸桿菌代謝物在瓊脂中充分?jǐn)U散。隨后將平板置于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h,觀察抑菌圈,測抑菌圈大小(抑菌圈大小=(外直徑-內(nèi)直徑)/2)。酶標(biāo)法[14]:將OD630為0.2的指示菌稀釋10倍,作為酶標(biāo)板指示菌液。每孔加入20μL丙酸桿菌代謝產(chǎn)物和180μL指示菌,每個(gè)樣品5個(gè)平行,并設(shè)置空白組和對照組,30℃恒溫培養(yǎng)6h。在酶標(biāo)檢測儀上測定每孔的OD630值,OD值為對照組一半時(shí)代謝物的稀釋度為一個(gè)抑菌活性單位(AU)。

1.2.3 培養(yǎng)基替代物的選擇 分別選擇玉米漿干粉和7種植物水解蛋白(小麥水解蛋白、HVP-FSA、HVP-FSC、HVP-B、HVP-AK、HVP-AG、EVP-AA)來代替現(xiàn)有培養(yǎng)基中的酵母提取物,添加量為10g/L,考察丙酸桿菌代謝物的抑菌性。

分別選擇大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨和3種水解植物蛋白(HVP-FSC、HVP-AG、HVP-AK)來代替現(xiàn)有培養(yǎng)基中的胰蛋白胨,添加量為10g/L,考察丙酸桿菌代謝物的抑菌性。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分 采用Design Expert8. 0 軟件進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇對丙酸桿菌抑菌性代謝物產(chǎn)量有顯著影響的三個(gè)因素(葡萄糖、大豆蛋白胨、玉米漿)作為Box-Behnken設(shè)計(jì)所考察的變量,各因素與編碼水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of variables in Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分篩選

2.1.1 培養(yǎng)基中酵母提取物替代物的篩選 酵母提取物含有氨基酸、多肽、維生素、核甘酸及微量元素等多種營養(yǎng)物質(zhì),是實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基成分,但用作工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基成分,酵母提取物價(jià)格略高。本實(shí)驗(yàn)考慮用工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基原料玉米漿和植物蛋白水解物來代替原培養(yǎng)基中的酵母提取物,添加量為10g/L。實(shí)驗(yàn)選擇了7種水解植物蛋白和玉米漿干粉代替培養(yǎng)基中酵母提取物,考察其對丙酸桿菌代謝物抑菌活性的影響,結(jié)果如圖1所示。以玉米漿干粉替代酵母提取物時(shí),丙酸桿菌代謝物的抑菌活性最高,為25.5AU/mL，瓊脂擴(kuò)散法所測的抑菌圈最大,為11mm。在幾種水解植物蛋白中,以水解大豆蛋白EVP-AA代替酵母提取物時(shí)所產(chǎn)抑菌性物質(zhì)活性較高,但加入該物質(zhì)后培養(yǎng)基顏色深,影響最終產(chǎn)品的外觀。其它幾種植物水解蛋白對代謝物抑菌活性的影響和酵母提取物相差不大。從結(jié)果來看,抑菌圈測定結(jié)果與活性單位法有一定偏差,這主要是因?yàn)橐志Ψㄟm合作為定性測定方法,作為定量方法,偏差較大。玉米漿干粉營養(yǎng)豐富,代替酵母提取物可以促進(jìn)抑菌物質(zhì)的活性,而且其來源廣,成本低,故選用玉米漿干粉替代原發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物。

圖1 不同物質(zhì)替代酵母提取物對丙酸桿菌代謝物抑菌性的影響Fig.1 Effect of alternatives of yeast extract on antimicrobial properties of Propionibacterium metalibalite

2.1.2 培養(yǎng)基中胰蛋白胨替代物的篩選 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用玉米漿干粉替代培養(yǎng)基中的酵母提取物,分別選取大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨和3種水解植物蛋白(HVP-FSC、HVP-AG、HVP-AK)替換原培養(yǎng)基中的胰蛋白胨,添加量為10g/L,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)以大豆蛋白胨替代胰蛋白胨時(shí),丙酸桿菌代謝物的抑菌性最高。魚粉蛋白胨和胰蛋白胨對抑菌性代謝物活性的影響相當(dāng)。而三種植物水解蛋白所產(chǎn)生的抑菌代謝物的活性均較低?？梢?用大豆蛋白胨代替胰蛋白胨是可行的,促進(jìn)了抑菌性代謝物的產(chǎn)生。

圖2 不同物質(zhì)替代胰蛋白胨對丙酸桿菌代謝物抑菌性的影響Fig.2 Effect of alternatives of tryptone on the antimicrobial properties of Propionibacterium metalibalite

2.2 培養(yǎng)基各成分添加量對抑菌活性的影響

2.2.1 葡萄糖濃度對代謝物抑菌性的影響 在其它培養(yǎng)基組分不變時(shí),考察了葡萄糖添加量對丙酸桿菌代謝物抑菌性的影響。由圖3可見,隨著葡萄糖濃度的增加,代謝物抑菌活性增強(qiáng),當(dāng)葡萄糖濃度為10g/L時(shí),代謝物抑菌活性為26.4AU/mL;但當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)增加時(shí),代謝物抑菌活性反而下降,原因可能是過高的葡萄糖濃度導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)酸較多,抑制了細(xì)菌的生長,影響丙酸桿菌肽類抑制物的合成。在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi),葡萄糖的最佳濃度為10g/L。

圖3 葡萄糖濃度對代謝物抑菌性的影響Fig.3 Effect of glucose content on antimicrobial activity

2.2.2 大豆蛋白胨濃度對代謝物抑菌性的影響 如圖4所示,當(dāng)大豆蛋白胨濃度達(dá)到5g/L時(shí),代謝物抑菌活性為25.5AU/mL;但當(dāng)大豆蛋白胨濃度繼續(xù)增加時(shí),代謝物抑菌活性反而下降,這表明過高的大豆蛋白胨濃度不利于抑菌性代謝物的產(chǎn)生。

圖4 大豆蛋白胨濃度對代謝物抑菌性的影響Fig.4 Effect of soy peptone on antimicrobial activity

2.2.3 玉米漿濃度對代謝物抑菌性的影響 玉米漿濃度對丙酸桿菌代謝物抑菌性的影響如圖5所示,當(dāng)玉米漿濃度為10g/L時(shí),代謝物抑菌活性為26.8AU/mL;當(dāng)玉米漿濃度繼續(xù)增加時(shí),對抑菌性代謝物的產(chǎn)生沒有顯著影響。在本實(shí)驗(yàn)考察的范圍內(nèi),玉米漿的濃度以10g/L為宜。

圖5 玉米漿濃度對代謝物抑菌性的影響Fig.5 Effect of corn steep liquor content on antimicrobial activity

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過對培養(yǎng)基成分的篩選,初步判定用玉米漿替代酵母提取物、大豆蛋白胨替代胰蛋白胨優(yōu)化效果顯著。實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)基主要成分葡萄糖、大豆蛋白胨、玉米漿為考察因子,采用Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[15]進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成。實(shí)驗(yàn)共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),其中12個(gè)為析因點(diǎn),5個(gè)為中心點(diǎn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,所得回歸方程為:

Y=28.18-4X1+0.8X2+2.18X3+0.12X1X2+1.33X1X3-1.33X2X3-4.45X12-1.75X22-1.55X32

其中,Y為代謝物抑菌活性;X1為葡萄糖含量;X2為大豆蛋白胨含量;X3為玉米漿含量。

該模型方程方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi),回歸模型非常顯著(p<0.001),模型失擬項(xiàng)影響不顯著(p=0.1054),說明所擬合的二次回歸方程合適,能夠正確反應(yīng)抑菌活性與葡萄糖、大豆蛋白胨和玉米漿之間的關(guān)系。決定系數(shù)(R2)=0.9799,表明回歸方程的擬合度較好?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析表明,因素X1(葡萄糖)、因素X3(玉米漿)對抑菌性代謝物活性的線性效應(yīng)極顯著(p<0.01),X1X2的交互影響不顯著(p>0.05)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental design and result of Box-Behnken

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

注:p<0.05為顯著,p<0.01為極顯著,p>0.05為不顯著。

利用響應(yīng)面曲線所具有的特性,在盡可能節(jié)省實(shí)驗(yàn)次數(shù)的條件下,尋求一種既能改善現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)水平,又甚至接近最優(yōu)點(diǎn)的方法[16]。通過Design-Expert軟件對三個(gè)實(shí)驗(yàn)因素分別兩兩交互,做出二次回歸方程的響應(yīng)面及等高線,如圖6所示。由圖6可以看出,影響薛氏丙酸桿菌代謝物抗菌性最顯著的因素為葡萄糖(X1),表現(xiàn)為其響應(yīng)面變化弧度較大。大豆蛋白胨(X2)和玉米漿(X3)響應(yīng)面弧度變化平緩,說明對響應(yīng)值影響相對較小。大豆蛋白胨在響應(yīng)圖中呈現(xiàn)較為完整的弧型,說明在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi),響應(yīng)值隨大豆蛋白胨含量先上升后下降。圖形中葡萄糖隨著添加量的升高,響應(yīng)值下降,說明最佳取值應(yīng)靠近較低濃度的葡萄糖含量。玉米漿在響應(yīng)面圖形中其最佳取值靠近編碼值的右側(cè),即較高濃度的玉米漿含量。

圖6 各因素交互作用對代謝物抑菌活性影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plots showing the cross effects of factors on antimicrobial activity

對回歸方程進(jìn)行分析,可得到響應(yīng)面最佳條件及抑菌性代謝物活性預(yù)測值,本實(shí)驗(yàn)中,得到的最佳理論條件為:X1=-0.369,X2=0.012,X3=0.538,即葡萄糖的添加量為8.2g/L,大豆蛋白胨的添加量為5.1g/L,玉米漿的添加量為12.7g/L,在該條件下理論預(yù)測抑菌活性為29.5AU/mL。對預(yù)測的最佳點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次,得出代謝物抑菌活性分別為28.9,30.0,29.3AU/mL,平均抑菌活性為29.4AU/mL,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型吻合較好。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化前后的抑菌活性與成本

通過對比培養(yǎng)基優(yōu)化前后代謝物的抑菌活性,丙酸桿菌在優(yōu)化后的培養(yǎng)基上所產(chǎn)代謝物平均抑菌活性為29.4AU/mL,而在原始培養(yǎng)基上所產(chǎn)代謝物平均抑菌活性為18.7AU/mL,抑菌性提高了57.2%。優(yōu)化后不僅降低了葡萄糖的使用量,而且培養(yǎng)基主要成分玉米漿替換原始培養(yǎng)基中的酵母提取物、大豆蛋白胨代替原始培養(yǎng)基的胰蛋白胨,成本顯著降低。可見,丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后不僅提高了代謝物抑菌活性,而且大大降低了培養(yǎng)基成本,為該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了薛氏丙酸桿菌產(chǎn)抑菌性代謝物的培養(yǎng)基,篩選出玉米漿干粉和大豆蛋白胨分別代替原培養(yǎng)基中的酵母提取物和胰蛋白胨,并依據(jù)響應(yīng)面分析中的Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基各成分含量進(jìn)行優(yōu)化,所得薛氏丙酸桿菌產(chǎn)抑菌性代謝物的最佳培養(yǎng)基組成為:葡萄糖8.2g/L,大豆蛋白胨5.1g/L,玉米漿12.7g/L,模型預(yù)測抑菌性最高可達(dá)29.5AU/mL,與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的29.4AU/mL非常接近,說明了該模型有較好擬合性。優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵丙酸桿菌不僅使代謝物抑菌活性提高了57.2%,而且培養(yǎng)基成本大大降低,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)丙酸桿菌抑菌性代謝物作為新型食品防腐劑奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization research of fermentation mediums forantimicrobial metabolites producing strainPropionibacteriumshermanii

PAN Miao1,FU Ya-xin1,HONG Feng1,YANG Xue-xia1,*,GAO Hong-liang2

(1.College of Chemistry Chemical Engineering and Biotechnology,Dong Hua University,Shanghai 201620,China;2.School of Life Sciences,East China Normal University,Shanghai 200062,China)

The fermentation medium was optimized to reduce the medium cost and promote the antimicrobial metabolites production ofPropionibacteriumshermaniiby simple factor experiment and response surface methodology. The results showed that the yeast extract and tryptone of original medium could be replaced by the corn steep liquor power and soy peptone. According to Box-Behnken design and response surface methodology,the optimal medium were as follows:glucose 8.2g/L,soy peptone 5.1g/L,and corn steep liquor 12.7g/L. After medium optimization,the theory value of antimicrobial activity was 29.5AU/mL,and was improved by 57.2%. The actual operation of the experiment turned out to be 29.4 AU/mL,and the medium cost was reduced.

Propionibacterium;antimicrobial metabolites;medium optimization;response surface methodology

2014-10-23

潘淼(1990-)，男，碩士，研究方向：食品微生物。

*通訊作者:楊雪霞(1971-)，女，碩士，副教授，研究方向：細(xì)菌纖維素的高效生產(chǎn)。

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(11D10509)；國家大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(12T1050401)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.026