釀酒酵母組成型表達(dá)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1及相關(guān)性質(zhì)研究

王 鈺,陳量量,杜 婷,李 艷,嚴(yán) 明,郝 寧,許 琳

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

釀酒酵母組成型表達(dá)甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1及相關(guān)性質(zhì)研究

王 鈺,陳量量,杜 婷,李 艷*,嚴(yán) 明,郝 寧,許 琳

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 211816)

本研究將釀酒酵母穿梭質(zhì)粒pESC-Leu的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1和GAL10分別替換為PGK1和TEF1啟動(dòng)子,構(gòu)建了組成型雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pESCD,再將甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的編碼基因亞克隆到pESCD的SalI和XhoI酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建了組成型表達(dá)UGT76G1的重組質(zhì)粒pESCD-UGT。將pESCD-UGT轉(zhuǎn)化到釀酒酵母YPH499中進(jìn)行表達(dá),結(jié)果確定該重組酵母在SD-L液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h達(dá)到穩(wěn)定期,菌體培養(yǎng)8h蛋白表達(dá)量高,選用1%的甲苯作為重組菌全細(xì)胞催化的通透劑時(shí),催化15h產(chǎn)生288mg/L的萊鮑迪甙A,其產(chǎn)量是對(duì)照組的5倍。

釀酒酵母,組成型啟動(dòng)子,糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1,全細(xì)胞催化,萊鮑迪甙A

植物來源的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的一個(gè)重要分支。通過該酶的轉(zhuǎn)糖基作用,有利于改變受體分子的穩(wěn)定性、可溶性,提高解毒功能等。每種植物中都有多種UGTs,它們對(duì)底物的作用位點(diǎn)具有高度的特異性[1]。其中,糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1能將甜菊糖中具有后苦味的甜菊甙(Stevioside,St甙)通過一步糖基化反應(yīng)生成萊鮑迪甙A(Rebaudioside A,RA甙)[2]。RA甙是一種無毒、安全、高甜度的天然甜昧劑,口味純正[3-4],得到歐美國家的接受和推崇。市售甜菊糖一般以St甙為主要組分,但其略帶甘苦味影響了甜菊糖的口感。因此,提高RA甙在甜菊糖總甙中的相對(duì)含量有助于改善甜菊糖味質(zhì)。

在UGT76G1所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中需要以昂貴的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作為糖基供體,必然影響RA甙酶促合成應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性。全細(xì)胞催化技術(shù)利用受細(xì)胞壁保護(hù)的胞內(nèi)酶系,穩(wěn)定性更好,同時(shí)避免向反應(yīng)體系中額外添加UDPG,降低了生產(chǎn)成本,在生物催化領(lǐng)域中具有很大的優(yōu)勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行的全細(xì)胞催化合成RA的工作中[5],由于采用pESC-Leu作為表達(dá)載體,該載體的GAL1和GAL10啟動(dòng)子受半乳糖誘導(dǎo),受葡萄糖阻遏[6-8],因此重組酵母的培養(yǎng)和重組酶的表達(dá)一般分階段進(jìn)行,并且需要加入半乳糖作為誘導(dǎo)劑,從而實(shí)驗(yàn)周期過長(zhǎng),操作繁瑣,不利于擴(kuò)大生產(chǎn)[9-10]。本研究中用組成型啟動(dòng)子PGK1和TEF1分別替換pESC-Leu的GAL1和GAL10啟動(dòng)子[11],構(gòu)建了新的表達(dá)載體pESCD。再將甜葉菊糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的編碼基因克隆到pESCD載體,用其轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499獲得組成型表達(dá)UGT76G1的重組酵母,并考察了該重組考察重組菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶性質(zhì),初步驗(yàn)證其全細(xì)胞催化甜菊甙合成萊鮑迪甙A的能力。這一工作縮短了重組菌培養(yǎng)及重組酶表達(dá)的周期,無需誘導(dǎo)劑,有利于降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 試劑

實(shí)驗(yàn)所用基因和引物 由南京金斯瑞公司合成;CloneEZ PCR Cloning Kit 購自南京金斯瑞公司;限制性內(nèi)切酶 購于NEB公司;TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶和2000、15000DNA Marker 購自Takara公司;質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA片段純化與膠回收試劑盒 購于上海申能博彩有限公司;St甙和 RA甙購自曲阜海根甜菊制品有限公司。

1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株E.coliDH5α 和釀酒酵母菌株saccharomycescerevisiaeYPH499為本實(shí)驗(yàn)室保藏,pMDTM-18T載體購自TaKaRa公司;pYES2-UGT為本實(shí)驗(yàn)之前構(gòu)建的帶UGT76G1糖基轉(zhuǎn)移基因的重組質(zhì)粒。

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉10g/L;釀酒酵母完全培養(yǎng)基YPD:酵母提取物10g,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L;釀酒酵母選擇培養(yǎng)基SD-L(SD基本培養(yǎng)基[12]缺乏亮氨酸),其中碳源為20g/L葡萄糖。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 組成型表達(dá)載體的構(gòu)建 在數(shù)據(jù)庫National Center for Biotechnology Information(NCBI)上檢索到TEF1和PGK1的基因序列,并參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)引物如下:

P1:5′-CCATTCTTTGAAGGTACTTCCGGCCGG CCGCACACACCATAGCTTCAAA-3′;

P2:5′-GTTGTTGCGGCCGCTTGTAATTAAAAC TTAGATTAGATTGC-3′;

P3:5′-GGAAGTACCTTCAAAGAATGG-3′;

P4:5′-GTTGTTGGATCCTTGTTTTATATTTGTT GTAAAAAGTAG-3′

其中P2和P4分別帶有NotI、BamH I酶切位點(diǎn)。

以YPH499基因組為模板分別用引物P1和P2 PCR擴(kuò)增片段pTEF1,引物P3和P4 PCR擴(kuò)增pPGK1片段。PCR在50μL體系中進(jìn)行,反應(yīng)條件為:98℃預(yù)變性5min;98℃變性10s,58℃退火15s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。獲得兩個(gè)pTEF1和pPGK1的PCR擴(kuò)增片段后,再使用融合PCR技術(shù)將pTEF1和pPGK1反向融合起來,得到新的目的片段。融合PCR的模板為pTEF1與pPGK1的PCR產(chǎn)物按等濃度的混合物,PCR體系50μL引物為P2、P4。將融合的PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pESC-Leu用NotI、BamH I 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng),再純化回收酶切后片段進(jìn)行連接,連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用經(jīng)酶切鑒定的陽性克隆送南京金斯瑞公司測(cè)序確認(rèn),獲得質(zhì)粒pESC-LeuD簡(jiǎn)稱pESCD。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)UGT基因序列和CloneEZ PCR Cloning Kit的引物設(shè)計(jì)原理合成引物如下:

P5:5′-CTATAGGGCCCGGGCGTCGACATGGAA AATAAGACTGAAACTACTG-3′;

P6:5′-GCGGTACCAAGCTTACTCGAGTTATAAT GATGAAATATAAGAAACC-3′

P5和P6分別帶有SalⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

以pYES2-UGT質(zhì)粒為模板,用引物P5和P6,PCR擴(kuò)增UGT基因。PCR在50μL體系中進(jìn)行,反應(yīng)條件為:98℃預(yù)變性5min;98℃變性10s,62℃退火15s,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。將經(jīng)SalI、XhoI雙酶切后的質(zhì)粒pESCD純化回收,與純化后的PCR產(chǎn)物用CloneEZ Enzyme進(jìn)行連接,連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用經(jīng)酶切鑒定的陽性克隆送南京金斯瑞公司測(cè)序確認(rèn),獲得重組質(zhì)粒pESCD-UGT。

1.4.3 重組UGT76G1的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pESCD-UGT采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母YPH499感受態(tài)細(xì)胞中,30℃培養(yǎng)約48h,在SD-L篩選平板上得到重組酵母YPH499(pESCD-UGT),挑取單菌落到SD-L培養(yǎng)液中,30℃振蕩培養(yǎng)活化。種子液按終OD600為0.4的接種量轉(zhuǎn)接于100mL新鮮SD-L液體中,30℃、200r/min培養(yǎng)8、12、16、24h。室溫6000r/min離心10min收集菌體、用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)懸浮洗滌后備用。

1.4.4 粗酶液的制備 取適量上述細(xì)胞加液氮反復(fù)研磨,用300μL 0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)重懸樣品,4℃、12000r/min離心15min。上清即為粗酶液,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)和酶催化實(shí)驗(yàn)。

1.4.5 粗酶催化反應(yīng) 在3mL的反應(yīng)體系中(1.2mmol/L St甙、4mmol/L UDPG、3mmol/L MgCl2、10μg/mL BSA、0.89mg粗酶、pH7.2),加入粗酶液反應(yīng),30℃反應(yīng)每隔1h取次樣,高溫加熱5min終止反應(yīng)。12000r/min離心1min后上清液用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析[12]。

1.4.6 全細(xì)胞催化方法 取30℃培養(yǎng)24h的重組釀酒酵母YPH499(pESCD-UGT)的濕菌體,用磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后轉(zhuǎn)移至50mL三角瓶中,在10mL體系(0.1mol/L磷酸鉀緩沖溶液,pH7.2)中加入終濃度為40g/L的葡萄糖,底物St甙2g/L,MgCl26g/L,15g/L檸檬酸鈉,并分別加入1%甲苯和10g/L普朗尼克F-68,于37℃,200r/min條件下進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。5、15、24h取樣離心去除菌體,上清95℃煮沸10min,樣品-20℃保存待液相分析。

1.4.7 色譜分析條件 色譜柱:Lichrospher NH2柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙睛∶水(80∶20,V∶V),用冰醋酸酸調(diào)節(jié)pH至4.56;流速:1mL/min;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 pESCD組成型載體的構(gòu)建與鑒定

以YPH499基因組為模板,經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到片段pPGK1、pTEF1,再使用融合PCR技術(shù)將pTEF1和pPGK1反向連接,得到新的目的基因片段,純化后的PCR片段用NotI、BamH I雙酶切,回收該片段,與同樣酶切處理的質(zhì)粒pESC-Leu連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒用BamH I和NotI對(duì)所提的重組克隆菌進(jìn)行雙酶切,酶切結(jié)果見圖1。4號(hào)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后有明顯的目的基因的條帶(1.4kb左右),經(jīng)測(cè)序后鑒定為陽性克隆。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pESCD如圖2所示。

圖1 pPGK1&pTEF1融合啟動(dòng)子的酶切驗(yàn)證Fig.1 pPGK1&pTEF1 fusion promoter enzyme cutting test 注:1～3:帶有pESC-Leu載體的假陽性克隆菌;4:帶有pESCD載體陽性克隆菌;5:DNA Marker DL2000。

圖2 空質(zhì)粒pESCD構(gòu)建示意圖Fig.2 Construction of plasmid pESCD

2.2 表達(dá)重組子pESCD-UGT的構(gòu)建與鑒定

以pYES-UGT質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到UGT片段,再使用SalⅠ、XhoⅠ雙酶切pESCD質(zhì)粒,純化回收該質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物,用CloneEZ Enzyme連接純化后的pESCD質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒用BamHⅠ對(duì)所提的重組克隆菌進(jìn)行雙酶切,酶切結(jié)果見圖3,1號(hào)重組質(zhì)粒酶切后有明顯的條帶,約750bp,與預(yù)期一致。構(gòu)建好的重組載體pESCD-UGT如圖4所示。

圖3 酶切pESCD-UGT鑒定Fig.3 Enzyme digestion of pESCD-UGT注:1:pESCD-UGT酶切產(chǎn)物;2:對(duì)照pESCD-UGT;3:DNA Marker DL15000。

圖4 重組質(zhì)粒pESCD-UGT構(gòu)建示意圖Fig.4 Construction of recombinant plasmid pESCD-UGT

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

由細(xì)胞破碎液上清的SDS-PAGE凝膠電泳圖(圖5)可知,與泳道1相比,泳道4、5在大約52ku處有外源蛋白表達(dá)條帶,與UGT分子量一致,說明UGT76G1已在重組菌YPH499(pESCD-UGT)中成功表達(dá)。通過對(duì)比泳道4～7可知在重組菌處于對(duì)數(shù)中期(培養(yǎng)8h)時(shí),目標(biāo)蛋白UGT61G1表達(dá)量最高。目標(biāo)蛋白表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低,該結(jié)果與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的PGK1啟動(dòng)子的性質(zhì)吻合。

圖5 細(xì)胞破碎液上清SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of the clear liquid of the cell disruption注:1,Marker-RM013;2,培養(yǎng)24h的重組菌YPH499(pESCD);4～7,分別為培養(yǎng)8、12、16和24h的重組菌YPH499(pESCD-UGT);8,Marker-R0571。

2.4 重組菌生長(zhǎng)與殘?zhí)橇康拇_定

如圖6所示,釀酒酵母YPH499(pESCD-UGT)以半皿/100 mL接入SD-L培養(yǎng)基時(shí),在16h后對(duì)數(shù)期基本結(jié)束進(jìn)入穩(wěn)定期,其OD600達(dá)到7.84。而培養(yǎng)24h時(shí),培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖基本耗盡,此時(shí)重組菌為穩(wěn)定期。對(duì)重組菌生長(zhǎng)狀況的初步研究為重組蛋白表達(dá)條件尤其是表達(dá)時(shí)機(jī)的選擇奠定了基礎(chǔ)。

圖6 重組菌YPH499(pESCD-UGT)生長(zhǎng)狀況與殘?zhí)顷P(guān)系Fig.6 Relationship of the growth and glucose concentration of recombinant

2.5 重組菌與對(duì)照菌的催化能力比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照菌(pESCD)本身也能夠催化生成RA甙,在4h后,重組酵母菌催化能力遠(yuǎn)大于原始菌,是原始菌的7～10倍。原始菌也能催化合成RA甙,可能是其具有相似結(jié)構(gòu)酶活中心的糖基轉(zhuǎn)移酶。

圖7 重組菌YPH499(pESCD-UGT)與YPH499(pESCD)酶催化合成RA甙比較Fig.7 Comparison of crude enzyme catalytic ability in YPH499(pESCD-UGT)and YPH499(pESCD)

2.6 重組菌YPH499(pESCD-UGT)的菌齡對(duì)粗酶催化能力的影響

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果知:收集SD-L培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體,處理后其粗酶催化能力最高,反應(yīng)4h后可催化產(chǎn)生300mg/L RA甙,粗酶催化能力隨所用重組細(xì)胞的菌齡的增長(zhǎng)而降低,這與重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜(圖5)顯示的結(jié)果相一致,培養(yǎng)8h的細(xì)胞中重組酶活力最高,隨著培養(yǎng)基中葡萄糖消耗,PGK1啟動(dòng)子作用下的重組酶的活力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低[11]。

2.7 全細(xì)胞催化反應(yīng)

將表達(dá)后的重組菌菌體離心,進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。結(jié)果如圖9所示,甲苯在此轉(zhuǎn)化體系中表現(xiàn)出較佳的通透性,催化能力是對(duì)照組的5倍。通透劑甲苯的加入,使底物St甙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),在UGT糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下釀酒酵母利用葡萄糖,將St甙轉(zhuǎn)化為RA甙。采用重組菌催化15h能產(chǎn)生288mg/L的RA甙,24h后RA甙產(chǎn)量略微降低為276mg/L?？赡苁怯捎赗A甙在酵母催化體系中不穩(wěn)定。

圖8 重組菌不同菌齡粗酶液催化能力比較Fig.8 Enzyme catalytic ability of the recombinants of different culture durations

圖9 不同通透條件下全細(xì)胞催化St甙合成RA甙Fig.9 The influence of different cell surfactant on the whole cell transformation

3 結(jié)論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1在釀酒酵母體系的組成型表達(dá),重組菌在SD-L液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后對(duì)數(shù)期基本結(jié)束進(jìn)入穩(wěn)定期,培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖基本耗盡。培養(yǎng)8h的重組菌的粗酶液中,目標(biāo)蛋白量及其酶催化能力優(yōu)于更長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的重組菌。選用1%甲苯比F-68的細(xì)胞通透效果更好,催化反應(yīng)在24h內(nèi)產(chǎn)物達(dá)到287.5mg/L最大值。后續(xù)研究中可考慮對(duì)組成型啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)選,使重組菌外源蛋白的表達(dá)水平與菌體生長(zhǎng)相協(xié)同,進(jìn)一步提高重組菌全細(xì)胞催化St甙產(chǎn)RA甙的能力。

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Constitutive expression and characteristics ofglycosyltransferase UGT76G1 inSaccharomycescerevisiae

WANG Yu,CHEN Liang-liang,DU Ting,LI Yan*,YAN Ming,HAO Ning,XU Lin

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In this study,a new expression vector pESCD which contains the two constitutive promoters,pPGK1 and pTEF1 that replaced the original induced promoter GAL1/GAL10 in pESC-Leu,was designed and constructed. The synthetic glycosyltransferase UGT76G1 coding gene was inserted into the restriction sites,SalI andXhoI of pESCD to construct the recombinant plasmid pESCD-UGT,which was then transformed into theSaccharomycescerevisiaestrain YPH499. The results confirmed that the recombinant cells grew into the stable phase when cultured for 24h and the highest expression of the recombinant protein was observed when cultured for 8h in SD-L. In case of 1% methylbenzence as the cell permeating agent,288mg/L RA was produced after reaction for 15h using the whole-cell catalyst,which was 5 times higher than that of thecontrol group.

Saccharomycescerevisiae;constitutive promoter;glycosyltransferase UGT76G1;whole cell transformation;rebaudioside A

2014-11-05

王鈺(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：生物催化。

*通訊作者:李艷(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：工業(yè)生物催化。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21106068)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2011801)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20113221120002)和江蘇省普通高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(10KJB530004)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)13-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.025