唾液及血漿中微小RNA-21水平應(yīng)用于早期食管癌的診斷價(jià)值

李 偉,閆叢臨,譚曉剛

(1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院胸外科 473009;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院胸外科，北京 100021)

唾液及血漿中微小RNA-21水平應(yīng)用于早期食管癌的診斷價(jià)值

李 偉1,閆叢臨1,譚曉剛2

(1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院胸外科 473009;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院胸外科，北京 100021)

目的 研究唾液及血漿中的微小RNA-21(miRNA-21)水平應(yīng)用于早期食管癌的診斷價(jià)值。方法 選取2011年2月至2014年2月河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的112例早期食管癌患者作為觀察組，同期來(lái)該院進(jìn)行健康查體的100例患者作為對(duì)照組，比較兩組查體者miRNA-21的表達(dá)水平，比較唾液和血漿miRNA-21的診斷價(jià)值；研究miRNA-21水平與腫瘤分期、病理類型和分化的相關(guān)性。結(jié)果 觀察組唾液miRNA-21水平為(6.08±2.22)，對(duì)照組為(0.64±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組的血漿miRNA-21表達(dá)水平為(20.91±10.59)，對(duì)照組為(1.69±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。唾液中的miRNA-21水平ROC曲線下面積(AUC)為0.866 5，靈敏度為88.24%，特異度為69.97%；血漿中的miRNA-21 AUC為0.882 0，靈敏度為90.20%，特異度為70.69%，二者診斷價(jià)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。唾液與血漿中的miRNA-21水平與早期食管癌的分期和病理類型無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)，與分化程度相關(guān)性較強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論 唾液及血漿中的miRNA-21水平應(yīng)用于早期食管癌具有較高的診斷價(jià)值，唾液可能代替血漿應(yīng)用于早期食管癌的診斷。

唾液；血漿；微小RNA-21；食管腫瘤；診斷價(jià)值

食管癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。中國(guó)是該疾病的高發(fā)地區(qū)之一，其發(fā)生率和病死率高居第4位。在我國(guó)，每年約15萬(wàn)人死于食管癌[1]。早期食管癌癥狀多不典型，主要表現(xiàn)為吞咽粗硬食物時(shí)的不適感，故多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)處于腫瘤的中晚期，治療效果和預(yù)后均不理想。因此，早期的診斷和干預(yù)對(duì)食管癌患者的意義重大。大量研究表明，微小RNA-21(miRNA-21)的表達(dá)水平與食管癌相關(guān)性較高[2]。同時(shí)，唾液含有多種血液中的分子物質(zhì)[3]，故本次研究選取112例食管癌患者作為研究對(duì)象，探討唾液及血漿中的miRNA-21水平在早期食管癌診斷中的應(yīng)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年2月至2014年2月河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的112例早期食管癌患者作為觀察組，其中男65例，女47例，年齡38～72歲，平均(54.2±14.3)歲。112例患者均行吞鋇X線食管攝片和纖維食管鏡檢查確診，TNM分期如下：Ⅰ期61例，Ⅱ期51例；鱗癌83例，非鱗癌29例；高分化72例，中分化27例，低分化13例。選取同一時(shí)期來(lái)該院進(jìn)行健康查體的100例查體者作為對(duì)照組，其中男52例，女48例，年齡38～72歲，平均(54.2±14.3)歲。兩組研究對(duì)象的性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對(duì)象均禁飲食10 h，于上午7:00左右在門診或病房采外周靜脈血4 mL，并將血液放置于外周抗凝管。在收集唾液前，需要禁口腔清潔，用檸檬酸濕潤(rùn)過(guò)的無(wú)菌棉簽刺激研究對(duì)象舌頭一側(cè)，以增加唾液量，使用59 mL的無(wú)菌無(wú)酶離心管收集唾液，反復(fù)操作，保證收集的唾液大于或等于3 mL。將收集到的樣本，在4 ℃的離心機(jī)中離心15 min，轉(zhuǎn)速為3 000 g，收集上清液置于EP管中，再以12 000 g的速度在4 ℃下離心10 min，將上清液置于-80 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 唾液及血漿中的miRNA-21水平檢測(cè) 應(yīng)用Ambion公司生產(chǎn)的mirVana PARIS Kit試劑盒對(duì)唾液和血漿中的總RNA-21進(jìn)行提取。DNA模板5 μL，PCR緩沖液2 μL，dNTP 2 μL，MgCl22 μL，引物1(upward，上海生物工程公司)0.5 μL，引物2(downward，上海生物工程公司)0.5 μL，dH2O 7.75 μL，Tag 0.25 μL，共20 μL配成反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄條件：94 ℃變性5 min，94 ℃ 1 min，5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，順序循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。擴(kuò)增方法如下：取3 μL反轉(zhuǎn)產(chǎn)物作為模板，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行擴(kuò)增，所有反應(yīng)均同時(shí)用3個(gè)復(fù)孔，循環(huán)50次，擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s。內(nèi)參選擇miR-16。溶解曲線：65.0～95.0 ℃，increment 0.5 ℃ for 0.05 min+plate read。采用Biorad公司的CFX962.1實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。miRNA-21的表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示[4]。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象唾液和血漿miRNA-21水平比較 觀察組唾液miRNA-21水平為(6.08±2.22)，對(duì)照組唾液miRNA-21水平為(0.64±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.982，P<0.05)；觀察組的血漿miRNA-21表達(dá)水平為(20.91±10.59)，對(duì)照組血漿miRNA-21表達(dá)水平為(1.69±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.113，P<0.05)。

2.2 唾液與血漿中miRNA-21水平的診斷價(jià)值比較 針對(duì)唾液中的miRNA-21水平構(gòu)建ROC曲線下面積(AUC)為0.866 5，血漿miRNA-21水平診斷早期食管癌的靈敏度為88.24%，特異度為69.97%(圖1A)。針對(duì)血漿中的miRNA-21水平構(gòu)建ROC曲線，AUC為0.882 0，血漿miRNA-21水平診斷早期食管癌的靈敏度為90.20%，特異度為70.69%(圖1B)。唾液與血漿中的miRNA-21水平的診斷價(jià)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 唾液與血漿中的miRNA-21水平與早期食管癌的分期、病理類型及分化的相關(guān)性 唾液與血漿中的miRNA-21水平與早期食管癌的分期和病理類型無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)，與分化程度相關(guān)性較強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

A：唾液;B:血漿。

圖1 miRNA-21水平的ROC曲線

3 討 論

食管癌是我國(guó)較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，男性發(fā)病率高于女性，它的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括遺傳因素、不良飲食習(xí)慣、抽煙、酗酒[5]。食管癌患者的早期癥狀多不明顯，且臨床上缺乏有效的診斷手段，給疾病的診斷帶來(lái)一定的困難，延誤治療。

研究中，112例早期食管癌患者的唾液miRNA-21水平較正常人群唾液平均上調(diào)超過(guò)10.5倍；患者血漿miRNA-21水平較正常人群血漿miRNA-21表達(dá)水平平均上調(diào)了15.3倍，這表明，與健康人群相比，早期食管癌的患者miRNA-21的水平明顯增加。這一結(jié)果與葉敏華等[6]的結(jié)果較為一致。惡性腫瘤是由細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而引起的疾病[7]。正常細(xì)胞內(nèi)存在多種抑癌基因和原癌基因，這些基因的突變和異常表達(dá)都可以導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程失控，形成腫瘤[8]。miRNA是一類非編碼的內(nèi)源性的RNA序列，研究表明，它可以通過(guò)調(diào)控相應(yīng)mRNA的翻譯和降解過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平，從而參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA與食管癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后具有一定的相關(guān)性：miR-21，它通過(guò)與細(xì)胞程序性死亡蛋白4(PDCD4) mRNA相結(jié)合，抑制了PDCD4的翻譯過(guò)程，增加了食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。劉清等[12]利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將miRNA-21抑制劑轉(zhuǎn)入食管鱗癌細(xì)胞Ecal09中，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的miRNA-21水平明顯下降，而PDCD4明顯上升，組織水平上miRNA-21與PDCD4呈負(fù)相關(guān)。因此miRNA-21水平在早期食管癌的診斷中具有一定的價(jià)值。本研究同時(shí)對(duì)患者唾液和血漿中的miR-21水平及其診斷價(jià)值進(jìn)行比較，唾液中的miRNA-21水平AUC為0.866 5，靈敏度為88.24%，特異度為69.97%；血漿中的miRNA-21 AUC為0.882 0，靈敏度為90.20%，特異度為70.69%，二者均具有較高的診斷價(jià)值。唾液腺的血流豐富，唾液中含有與血漿非常相似的分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和核酸。血漿中的蛋白質(zhì)、DNA和RNA通過(guò)水通道、直接擴(kuò)散和細(xì)胞間隙進(jìn)入唾液腺并分泌到唾液中，故唾液可以作為血漿的代替品，反應(yīng)機(jī)體內(nèi)的分子動(dòng)態(tài)變化[13]。研究認(rèn)為，腫瘤組織釋放的多種介質(zhì)可以通過(guò)脈管系統(tǒng)對(duì)遠(yuǎn)端的唾液腺等器官的生物功能進(jìn)行調(diào)控，增加或減少唾液中的蛋白質(zhì)、DNA和RNA的釋放。故唾液中miRNA-21的診斷價(jià)值與血漿miRNA-21相當(dāng)。檢測(cè)血漿的mi-RNA水平需要進(jìn)行有創(chuàng)操作，故需要有經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行操作。唾液中的mi-RNA水平檢測(cè)是無(wú)創(chuàng)性操作，但是影響因素較多，且唾液中含有多種酶類，可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。miRNA-21的穩(wěn)定性較差，故應(yīng)該嚴(yán)格按照流程操作，注意樣本的保存。

本次研究中，miRNA-21的水平與早期食管癌的病理分期和類型無(wú)明顯的相關(guān)性，與食管癌的分化程度相關(guān)性較強(qiáng)。Ⅰ期和Ⅱ期食管癌均屬于早期食管癌，差異并不明確；食管癌的分化程度是食管癌預(yù)后的重要不良因素，與miRNA-21水平的相關(guān)性較強(qiáng)，提示miRNA-21也可以作為預(yù)后判斷的指標(biāo)。

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Diagnostic value of application of salivary and plasma microRNA-21 in early esophageal cancer*

LiWei1,YanConglin1,TanXiaogang2

(1.DepartmentofThoracicSurgery,NanyangMunicipalCentralHospital,Nanyang,Henan473009,China;2.DepartmentofThoracicSurgery,TumorHospitalofChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021,China)

Objective To study the diagnostic values of salivary and plasma microRNA-21 for e early esophageal cancer.Methods Totally 112 patients with early esophageal cancer in Nanyang Municipal Central Hospital from February 2011 to February 2014 were selected as the observation group and contemporaneous 100 healthy people of physical examination were selected as the contract group.The salivary and plasma microRNA-21 expression levels were compared between the two groups;the diagnostic values of salivary versus plasma microRNA-21 for the early esophageal cancer were also compared;the correlation between the miRNA-21 level with the stage,pathogenic type and differentiation of early esophageal cancer.Results The salivary microRNA-21 level (6.08±2.22) in the observation group and (0.64±0.09) in the control group,the difference had statistical significance (P<0.05);the plasma microRNA-21 level in the observation group was (20.91±10.59) and (1.69±0.17) in the constract group,the difference had statistical significance (P<0.05).The area underROC curve(AUC) of salivary microRNA-21 level was 0.866 5,the sensitivity was 88.24%,the specificity was 69.97%;while AUC of plasma microRNA-21 level was 0.882 0,the sensitivity was 90.20%,the specificity was 70.69%,the differences in the diagnostic value had no statistical significance between them(P>0.05).The salivary and plasma microRNA-21 levels had no obvious correlation with the stage and pathogenic type of early esophageal cancer(P>0.05),while had strong correlation with the differentiation degree(P<0.05).Conclusion Salivary and plasma microRNA-21 has higher diagnostic value in for early esophageal cancer,and saliva may supplant plasma in the diagnosis of early esophageal cancer.

saliva;plasma;microRNA-21;esophageal neoplasms;diagnostic value

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101773)。 作者簡(jiǎn)介：李偉(1968-)，本科，副主任醫(yī)師，主要從事胸外科工作。

·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.008

R735.1

A

1671-8348(2015)14-1894-03

2015-01-10

2015-02-26)