脊柱結(jié)核椎間盤MMPs和TIMPs表達(dá)的意義

王 寒，蔣電明

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科 400016)

脊柱結(jié)核椎間盤MMPs和TIMPs表達(dá)的意義

王 寒，蔣電明△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科 400016)

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)在脊柱結(jié)核椎間盤中表達(dá)的意義。方法 選取該院2011年1月至2014年5月在脊柱外科接受手術(shù)治療的脊柱結(jié)核患者42例作為脊柱結(jié)核組(TB組)；選取同期因椎間盤突出接受手術(shù)治療的40例患者作為椎間盤突出組(ID組)；另選同期因外傷性脊柱骨折接受手術(shù)治療的患者34例作為對照組；應(yīng)用ELISA和免疫組織化學(xué)檢測受試者椎間盤中MMP-1、MMP-13、TIMP-1及TIMP-3的表達(dá)水平。結(jié)果 TB組中MMP-1、MMP-13和TIMP-3的表達(dá)水平，MMP-1/TIMP-1和MMP-13/TIMP-3比值均高于其他兩組，TIMP-1表達(dá)水平低于另兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MMPs和TIMPs在脊柱結(jié)核椎間盤破壞的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。

椎間盤；基質(zhì)金屬蛋白酶類；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；脊柱結(jié)核

WHO報道2010年全球新發(fā)結(jié)核病患者約880萬[1]。其中，1%～5%的人會發(fā)生脊柱結(jié)核[2]。脊柱結(jié)核占骨結(jié)核的50%～60%，可致骨破壞、脊柱畸形、脊髓神經(jīng)壓迫損傷、甚至截癱等，致殘率較高[3]。結(jié)核分枝桿菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，對結(jié)核患者的局部組織造成損傷，在脊柱結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。MMPs為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的重要細(xì)胞因子，MMPs在人體蛋白激酶活化作用下，具有降解細(xì)胞基底膜、分解ECM、減低細(xì)胞內(nèi)黏附力等作用，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)則為MMPs的特異性拮抗劑。本研究采用ELISA技術(shù)和免疫組化技術(shù)，檢測MMP-1,MMP-13,TIMP-1和TIMP-3在結(jié)核性椎間盤組織、退行性椎間盤組織和正常椎間盤組織內(nèi)的表達(dá)情況及差異性，旨在為闡明脊柱結(jié)核患者椎間盤損害的發(fā)生機(jī)制，為脊柱結(jié)核治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2011年1月至2014年5月在脊柱外科接受手術(shù)治療的脊柱結(jié)核患者42例作為脊柱結(jié)核組(TB組)，其中男24例，女18例，年齡21～72歲，平均(41.4±16.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：具有中度發(fā)熱、肢體乏力、腰痛和下肢肌力減退等脊柱結(jié)核的典型癥狀；患者血液檢查，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)，組織病理學(xué)檢查和影像學(xué)檢查，如X線攝影，計算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)均支持脊柱結(jié)核疾病診斷；排除獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，腫瘤和強(qiáng)直性脊柱炎的患者。選取同期因椎間盤突出接受手術(shù)治療的40例患者作為椎間盤突出組(ID 組)，其中男27例，女13例，年齡24～75歲，平均(42.3±17.2)歲。椎間盤突出組患者臨床癥狀以及影像學(xué)檢查均符合椎間盤突出癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選同期因外傷性脊柱骨折接受手術(shù)治療的患者34例作為對照組，其中男19例，女15例，年齡19～68歲，平均(39.4±16.6)歲?；颊呤中g(shù)前明確為外傷所致的脊柱骨折，手術(shù)前影像學(xué)檢查未有椎間盤退行性改變。排除脊柱相關(guān)性疾病，如脊柱結(jié)核、椎間盤突出、強(qiáng)直性脊柱炎的患者。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，所獲得的標(biāo)本均履行告知義務(wù)并簽署知情同意書，符合國務(wù)院頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理條例》的相關(guān)要求。

1.2 檢測儀器與試劑 MK3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司，采用ELISA免疫法測定MMP-1、MMP-13、TIMP-1及TIMP-3水平，試劑盒由上海生物科技有限公司提供，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。MMP-1和TIMP-1鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新公司，MMP-13和TIMP-3兔抗人單克隆抗體購自美國San Cruz公司，兩步法SP抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 外科手術(shù)獲得標(biāo)本后，經(jīng)兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家檢查，以確保樣本的準(zhǔn)確性。每位患者標(biāo)本均分成兩份，第1份制成石蠟切片行HE染色、免疫組化法;第2份進(jìn)行ELISA檢測。取部分組織以10%甲醛固定48 h，以石蠟包埋切片,部分組織迅速移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?供ELISA檢測。使用酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的光密度值。試驗(yàn)前先將椎間盤組織稱質(zhì)量，超聲波粉碎，加入PBS研磨制成勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA法測定兩組椎間盤組織中的MMP-1、MMP-13、TIMP-1及TIMP-3。按說明書進(jìn)行操作。所有髓核組織標(biāo)本用10%甲醛常規(guī)固定，石蠟包埋，4 μm切片，一片作常規(guī)HE染色，其余采用SP免疫組化方法檢測MMP-1、MMP-13、TIMP-1及TIMP-3的表達(dá)。所有免疫組化切片應(yīng)用Image-ProPlus 5.1圖像分析系統(tǒng)對所拍照片進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)取5個視野計算出平均值，作為這張切片的平均灰度值，以灰度值反映陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA檢測MMP-1、MMP-13、TIMP-1和TIMP-3在不同組髓核中的表達(dá) MMP-1、MMP-13、TIMP-1和TIMP-3在不同組椎間盤中均能檢測。TB組中MMP-1、MMP-13水平和TIMP-3水平，MMP-1/TIMP-1和MMP-13/TIMP-3比值均高于其他兩組，TIMP-1水平低于另兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 不同組髓核中MMP-1、TIMP-1和MMP-1/TIMP-1的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與ID組比較。

表2 不同組髓核中MMP-13、TIMP-3和MMP-13/TIMP-3的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與ID組比較。

表3 不同組髓核中MMP-1、TIMP-1和MMP-1/TIMP-1的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與ID組比較。

2.2 免疫組化檢測MMP-1、MMP-13、TIMP-1和TIMP-3在不同組髓核中的表達(dá) MMP-1、MMP-13、TIMP-1和TIMP-3陽性表達(dá)均分布于細(xì)胞質(zhì),呈黃色或棕黃色顆粒。對照組椎間盤組織中MMP-1和MMP-13的表達(dá)較少，TB組中MMP-1、MMP-13和TIMP-3表達(dá)，MMP-1/TIMP-1和MMP-13/TIMP-3比值均高于其他兩組，TIMP-1表達(dá)低于另兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、4。

表4 不同組髓核中MMP-13、TIMP-3和MMP-13/TIMP-3的比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與ID組比較。

3 討 論

椎間盤破壞是脊柱結(jié)核的一個特征性改變。蛋白多糖是穩(wěn)定椎間盤結(jié)構(gòu)的重要成分，核心蛋白又是人體蛋白多糖的主要功能區(qū)。MMPs是核心蛋白的重要降解酶[4-5]，其高水平表達(dá)有利于結(jié)核分枝桿菌的組織播散[6]。TIMPs是MMPs的特異性抑制物，MMPs與TIMPs兩者之間的平衡狀態(tài)，直接影響了體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)的降解情況。

MMP-1主要降解Ⅰ、Ⅱ,Ⅲ和Ⅹ型原纖維膠原。TIMP-1對所有膠原酶的活性均有抑制作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌對MMP-1表達(dá)具有特異性上調(diào)的作用[8-9]。而新近研究表明，多臟器受累的結(jié)節(jié)病患者的MMP-1基因表達(dá)顯著增加，空洞性肺結(jié)核病患者的MMP-1基因表達(dá)也呈現(xiàn)明顯增加趨勢[10]。梁莉等[11]發(fā)現(xiàn)MMP-1高表達(dá)是支氣管結(jié)核狹窄的危險因素，參與了支氣管結(jié)核的發(fā)病。本研究顯示3組髓核均有MMP-1及TIMP-1表達(dá)，TB組中有高表達(dá)的MMP-1，而TIMP-1增加甚少，MMP-1/TIMP-1失調(diào)，TIMP-1不能抑制MMP-1對細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解，導(dǎo)致Ⅱ型膠原過度降解，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維的結(jié)構(gòu)破壞，髓核空洞形成、纖維化，甚至椎間盤破壞、塌陷，對脊髓容易形成壓迫，發(fā)生癱瘓等嚴(yán)重并發(fā)癥。

MMP-13又稱膠原酶-3，具有極強(qiáng)的Ⅱ型膠原降解能力。MMP-13的高表達(dá)有利于結(jié)核破壞部位的細(xì)胞外基質(zhì)降解，與結(jié)核擴(kuò)散轉(zhuǎn)移及其預(yù)后密切相關(guān)。動物研究發(fā)現(xiàn)椎間盤在負(fù)荷狀態(tài)下發(fā)生退變，其組織中MMP-13表達(dá)也顯著增強(qiáng)[12-13]。國內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-13顯著表達(dá)可以有效降解椎間盤髓核的Ⅱ型膠原，從而導(dǎo)致椎間盤髓核細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解。Gonzlez-Avila等[14]證實(shí)結(jié)核分枝桿菌通過增加人肺成纖維細(xì)胞中MMP-1和MMP-13的表達(dá)，參與了多種膠原蛋白的合成和降解。本研究發(fā)現(xiàn)，TB組的MMP-13表達(dá)顯著增高，明顯高于ID組和對照組，而TIMP-3雖有增加，MMP-3 /TIMP-3比值進(jìn)一步擴(kuò)大，TIMP-3不能調(diào)控MMP-3對Ⅱ型膠原的過度降解，可見MMP-13同樣參與了椎間盤的結(jié)核性破壞過程，而且比在椎間盤退行性過程中表達(dá)更加強(qiáng)烈，作用更加明顯。

MMPs和TIMPs在脊柱結(jié)核椎間盤的破壞性過程中發(fā)揮了重要的作用，但是脊柱結(jié)核的發(fā)病機(jī)制是一個十分復(fù)雜的過程，而MMPs和TIMPs參與脊柱結(jié)核椎間盤破壞的發(fā)病機(jī)制中的具體作用環(huán)節(jié)還不明了，需要進(jìn)一步深入研究。

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Expression and significance of MMPs and TIMPs in intervertebral disc of spinal tuberculosis

WangHan,JiangDianming△

(DepartmentofOrthopedic,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To investigate the expression and significance of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase (TIMPs) in intervertebral disc of spinal tuberculosis.Methods Forty two cases of spinal tuberculosis underwent surgical treatment in our hospital from January 2011 to May 2014 were collected as tuberculosis group (TB group);forty patients who underwent surgery for lumbar disc herniation were selected as lumbar disc herniation (ID group);and other 34 cases of fracture patients underwent surgery due to trauma spine were collected as the control group;enzyme linked immunosorbent assay and immunohistochemical detection were used to detect the expression level of MMP-1,MMP-13,TIMP-1 and TIMP-3 of the subjects in intervertebral disc.Results The expression levels of MMP-1,MMP-13 and TIMP-3,MMP-1/TIMP-1 and MMP-13/TIMP-3 ratio in TB group were higher than those of the other two groups,the expression level of TIMP-1 was lower than that of the other two groups,the differences were statistically significant (P<0.05).Conclusion MMPs and TIMPs play important role in the pathogenesis of the intervertebral disc damage in spinal tuberculosis.

intervertebral disk;matrix metalloproteinases;tissue inhibitors of metalloproteinases;spinal tuberculosis

王寒(1988-)，在讀碩士，主要從事骨科脊柱的研究?！?/p>

，Tel:(023)62385326；E-mail:1940594497@qq.com。

·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.21.016

R681.5

A

1671-8348(2015)21-2926-02

2015-01-19

2015-03-25)