鹿茸和大豆蛋白酶解物3ku超濾組分的制備及其對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖影響的研究

趙 磊，王 旋,謝嶠菲,李思然,吳 迪,倪昌征

(北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

鹿茸和大豆蛋白酶解物3ku超濾組分的制備及其對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖影響的研究

趙 磊，王 旋,謝嶠菲,李思然,吳 迪,倪昌征

(北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

以鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白為原料,采用模擬胃腸消化和堿性蛋白酶水解,根據(jù)游離氨基含量變化優(yōu)化水解時(shí)間,制備鹿茸蛋白和大豆分離蛋白酶解物。通過超濾分離獲得各酶解物分子量<3ku的組分:鹿茸蛋白模擬胃腸消化物組分(VAWP-SGD)、鹿茸蛋白堿性蛋白酶解物組分(VAWP-APH)、大豆分離蛋白模擬胃腸消化物組分(SPI-SGD)、大豆分離蛋白堿性蛋白酶解物組分(SPI-APH),探究各組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明:模擬胃腸消化時(shí)間為胃蛋白酶2h+胰酶5h;堿性蛋白酶水解時(shí)間4h。在無誘導(dǎo)劑時(shí),VAWP-SGD和SPI-SGD對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖均有顯著促進(jìn)作用(≥100μg/mL)。VAWP-SGD對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最顯著,其次是VAWP-APH,SPI-APH無明顯作用,SPI-SGD對(duì)脾細(xì)胞增殖有輕微抑制作用。VAWP-SGD對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾B細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最強(qiáng),其次是VAWP-APH,SPI-APH及SPI-SGD。綜上,VAWP-SGD對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖影響最大,對(duì)進(jìn)一步開發(fā)鹿茸產(chǎn)品和免疫活性肽具有重要意義。

鹿茸水溶性蛋白,大豆分離蛋白,體外模擬胃腸消化,堿性蛋白酶,小鼠脾細(xì)胞

亞健康狀態(tài)越來越引起人們的關(guān)注,其表現(xiàn)多種多樣,最本質(zhì)、最核心的問題是人體自身免疫功能失調(diào)[1]。通過免疫調(diào)節(jié)改善自身免疫狀況,是人們遠(yuǎn)離亞健康的最理想方法。免疫活性肽因其安全、易吸收、用量少、生物活性高的優(yōu)勢越來越具有研究及市場價(jià)值,其可通過促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、提高巨噬細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞因子生成等[2-3]來提高機(jī)體免疫力。鹿茸作為中華養(yǎng)生五大圣品之一,其蛋白含量豐富,占干重的52%以上[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)鹿茸蛋白具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、治療神經(jīng)損傷等多種生物學(xué)效應(yīng)[5-8],但就鹿茸蛋白被分解成何種小分子肽從而發(fā)揮功能活性仍未見報(bào)道。大豆肽有降低血清膽固醇、降血壓、增加免疫和促進(jìn)脂肪代謝等多種生物活性[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)多肽鏈中的肽類物質(zhì)的生理活性往往更強(qiáng)于其母體蛋白[11],為了更高效的利用鹿茸水溶性蛋白和大豆蛋白挖掘免疫活性肽,對(duì)鹿茸水溶性蛋白和大豆蛋白不同酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性的研究顯得尤為重要。

本研究確定了制備鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白模擬胃腸消化物及堿性蛋白酶解物的最佳水解時(shí)間,研究了這幾種蛋白酶解物中分子量<3ku肽段對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。旨在探討和比較不同來源和不同蛋白酶作用獲得多肽的免疫調(diào)節(jié)活性,為利用鹿茸和大豆制備免疫活性肽提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮馬鹿茸 由大興安嶺區(qū)科技局提供;大豆分離蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;SPF級(jí)Balb/c小鼠(合格證號(hào):SCXK(京)2012-0001),6～8周齡,雌性 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶,胰酶 美國Sigma化學(xué)公司;堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司;刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS) 美國MP Biomedical公司;RPMI-1640高糖培養(yǎng)基 美國Gibico公司;青鏈霉素混合液、紅細(xì)胞裂解液、CCK-8試劑盒、Hepes 碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;5、10ku超濾膜包 美國Millipore公司;3ku超濾離心管 德國Sartorius公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

FD-1B-80型冷凍干燥機(jī) 南京普森儀器;TGL-10C型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海智城分析儀器制造有限公司;WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;UV-2450型紫外可見光分光光度計(jì) 日本島津;XX80EL005可調(diào)速超濾儀 美國Millipore公司;Axiovert 200型倒置顯微鏡 德國Zeiss公司;Eclipse Ci-L熒光顯微鏡 日本Nikon公司;Galaxy S型CO2培養(yǎng)箱 英國RS Biotech公司;SpectraMax i3型多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿茸水溶性蛋白的制備 取新鮮馬鹿茸經(jīng)冷凍干燥后低溫粉碎制成鹿茸粉末。采用文獻(xiàn)[12]報(bào)道方法提取鹿茸水溶性蛋白,經(jīng)梯度鹽析、透析、冷凍干燥得蛋白凍干粉,經(jīng)計(jì)算水溶性蛋白得率為25.5%。蛋白凍干粉于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同蛋白酶解物的制備和分離 根據(jù)酶解過程中游離氨基含量變化優(yōu)化酶解時(shí)間,確定反應(yīng)條件后制備不同蛋白酶解物。

1.2.2.1 模擬胃腸消化蛋白時(shí)間的確定 在底物蛋白濃度為25mg/mL、胃蛋白酶4%(w/v)、pH1.5條件下反應(yīng)3h,之后添加胰酶4%(w/v)、pH7.0條件下繼續(xù)水解8h。每小時(shí)取樣測游離氨基含量變化優(yōu)化酶解時(shí)間。

1.2.2.2 堿性蛋白酶水解蛋白時(shí)間的確定 在底物蛋白濃度為30mg/mL、堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、pH9.5條件下水解10h。每小時(shí)取樣檢測游離氨基含量變化優(yōu)化酶解時(shí)間。

1.2.2.3 游離氨基含量的測定 采用茚三酮法[13]測定不同蛋白酶解物中的游離氨基含量。以亮氨酸Leu為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程為y=3.7459x+0.022,R2=0.9933。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶解液中-NH2含量(mmol/g)。

1.2.2.4 蛋白酶解物的分離 選用截留分子量為10、5ku的超濾膜包和3ku的超濾離心管將蛋白酶解物超濾,獲得各組分經(jīng)冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 參考文獻(xiàn)[14]，將Balb/c小鼠拉頸處死,無菌分離完整脾臟,用PBS沖去浮血,剝除結(jié)締組織及脂肪成分。將脾臟置于小燒杯上的200目不銹鋼濾網(wǎng)上,剪碎并用注射器針芯研磨。用PBS液洗滌,用吸管收集細(xì)胞液至離心管,1000r/min離心5min,棄上清液,加入3mL紅細(xì)胞裂解液,靜置2min,加入10mL PBS終止反應(yīng),1200r/min離心5min,棄上清液。用PBS液洗兩次,不完全RPMI-1640洗一次,加適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/L Hepes)重懸細(xì)胞。調(diào)整濃度至2×106個(gè)細(xì)胞/mL。

1.2.3.2 脾淋巴T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將上述脾細(xì)胞懸液按100μL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中,正常對(duì)照組為脾細(xì)胞懸液,ConA對(duì)照組為含有ConA(終濃度為5μg/mL)的脾細(xì)胞懸液,樣品對(duì)照組為含有不同濃度樣品的脾細(xì)胞懸液,樣品組為含有含有ConA(終濃度為5μg/mL)和不同濃度樣品的脾細(xì)胞懸液;隨后用PBS補(bǔ)足使各組終體積為120μL。每個(gè)處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔,然后將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.2.3.3 脾淋巴B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 方法同1.2.3.2,將誘導(dǎo)劑ConA換作LPS(終濃度為10μg/mL)。

1.2.3.4 細(xì)胞增殖程度的測定及計(jì)算分析 本實(shí)驗(yàn)選用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞增殖程度。結(jié)果用刺激指數(shù)(Simulation index,SI)表示,公式如下:

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次,數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示,組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 模擬胃腸消化過程中游離氨基含量變化 蛋白質(zhì)在消化過程中被蛋白酶作用分解成不同分子量的肽段和氨基酸,隨時(shí)間的延長酶解產(chǎn)物分子量變小,蛋白酶作用位點(diǎn)逐漸減少,酶解體系成分趨于穩(wěn)定游離氨基含量不再變化。鹿茸蛋白和大豆分離蛋白在模擬胃腸消化過程中游離氨基含量變化如圖1所示。由圖可知游離氨基含量在胃蛋白酶作用下變化較小,進(jìn)入胰酶作用階段迅速增加隨時(shí)間延長趨于穩(wěn)定,兩種蛋白在消化過程中游離氨基含量的變化趨勢相似。鹿茸水溶性蛋白游離氨基含量的變化在胃消化2h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),且含量增加較少。而在進(jìn)入腸消化階段的1h內(nèi)迅速由(0.91±0.05)mmol/g增加至(1.71±0.02)mmol/g。繼續(xù)腸消化游離氨基含量持續(xù)增加,在消化5h后達(dá)到最大值(2.63±0.04)mmol/g,之后游離氨基含量保持穩(wěn)定。大豆分離蛋白在胃消化2h后游離氨基含量達(dá)到穩(wěn)定值(0.79±0.02)mmol/g,進(jìn)入腸消化階段游離氨基含量迅速增加,在消化5h后達(dá)到最大值(3.83±0.05)mmol/g,之后再無顯著變化。游離氨基含量達(dá)到穩(wěn)定值,則蛋白水解充分酶解體系成分趨于穩(wěn)定,由此確定鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白模擬胃腸消化的時(shí)間為胃蛋白酶2h+胰酶5h。

圖1 模擬胃腸消化過程中鹿茸水溶性蛋白 和大豆分離蛋白游離氨基含量的變化Fig.1 Changes in the content of α-NH2during simulated gastrointestinal digestion of VAWP and SPI

2.1.2 堿性蛋白酶水解過程中游離氨基含量變化 鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白在堿性蛋白酶酶解過程中游離氨基含量變化如圖2所示。由圖看出,兩種蛋白游離氨基含量變化趨勢相近,在酶解初期含量迅速增加,而隨水解時(shí)間的延長趨于穩(wěn)定。加入堿性蛋白酶1h后,鹿茸蛋白游離氨基含量顯著提高(p<0.01)。反應(yīng)3h后游離氨基含量達(dá)到最大值(0.84±0.01)mmol/g,比水解前提高了2.5倍,之后無顯著變化,則鹿茸水溶性蛋白酶解完全時(shí)間為3h。大豆分離蛋白在酶解4h后游離氨基含量達(dá)到最大值(1.09±0.06)mmol/g,之后游離氨基含量保持穩(wěn)定,由此推斷大豆分離蛋白在酶解4h后水解充分,酶解物組成成分趨于穩(wěn)定。為防止大量制備酶解物時(shí)蛋白水解不完全,兩種蛋白均采用4h作為水解時(shí)間。

圖2 堿性蛋白酶水解過程中鹿茸水溶性蛋白 和大豆分離蛋白游離氨基含量的變化Fig.2 Changes in the content of α-NH2during alkaline protease hydrolysis of VAWP and SPI

綜合圖1和圖2可知,與堿性蛋白酶水解過程相比,鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白在模擬胃腸消化環(huán)境下游離氨基含量變化更大,水解度更高,由此推測酶解物中小分子量肽段所占百分比可能較高,而且小分子肽更易被吸收利用,此結(jié)果暗示著鹿茸蛋白和大豆蛋白的模擬胃腸消化物更易被吸收利用。

2.1.3 超濾分離不同蛋白酶解物 采用超濾技術(shù)分離制備分子量<3ku的組分,分別得到鹿茸蛋白模擬胃腸消化物組分(VAWP-SGD)、鹿茸蛋白堿性蛋白酶酶解物組分(VAWP-APH)、大豆分離蛋白模擬胃腸消化物組分(SPI-SGD)和大豆分離蛋白堿性蛋白酶酶解物組分(SPI-APH),各組分占總酶解物的百分比如表1所示。由表1看出,不同蛋白酶解物中分子量<3ku的組分百分含量不同,其中最高的是源自大豆分離蛋白模擬胃腸消化物的SPI-SGD,其次是鹿茸水溶性蛋白模擬胃腸消化物VAWP-SGD,而源自堿性蛋白酶解物的VAWP-APH和SPI-APH含量相對(duì)較低。顯然,模擬胃腸消化物中分子量<3ku組分的百分含量比堿性蛋白酶水解物中<3ku組分含量高,這也與其游離氨基含量較高相統(tǒng)一。

表1 不同蛋白酶解物中分子量<3ku的組分含量Table 1 The contents of <3ku ultrafiltration fractions in different hydrolysates

2.2 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

本研究通過各蛋白酶解物<3ku肽段對(duì)小鼠體外脾細(xì)胞增殖的影響來評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)作用。超濾所得分子量<3ku肽段對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響如圖3～圖5所示。

由圖3可知,當(dāng)濃度≤1μg/mL時(shí),VAWP-SGD、VAWP-APH、SPI-SGD和SPI-APH單獨(dú)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響均不顯著(p>0.05)。除VAWP-APH在濃度為10μg/mL時(shí)對(duì)脾細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用(p<0.05)外,兩種堿性蛋白酶解物<3ku組分在研究濃度范圍內(nèi)無明顯作用。在濃度≥100μg/mL時(shí),VAWP-SGD和SPI-SGD對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用,SI值最高分別達(dá)到1.16±0.10和1.16±0.01,與空白對(duì)照組相比增長了15.9%(p<0.05)和16.2%(p<0.05)。結(jié)果表明,同種蛋白酶作用下鹿茸蛋白源的<3ku組分和大豆蛋白源的<3ku組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖作用類似,其中模擬胃腸消化物組分均有明顯促進(jìn)作用。而同種蛋白由不同蛋白酶水解得到的酶解物<3ku組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖影響有顯著差異,其中模擬胃腸消化物分離組分有更明顯的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)椴煌瑏碓吹牡鞍装被峤M成有顯著差異,且因蛋白酶對(duì)肽鍵的水解專一性,得到了組成和結(jié)構(gòu)迥異的酶解物,從而對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同的影響。

圖3 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分 對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes注:*p<0.05,**p<0.01(與對(duì)照組比較),圖4、圖5同。

由圖4可知,在濃度為0.5～200μg/mL范圍內(nèi)VAWP-SGD對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用(p<0.05),其中在濃度為50μg/mL時(shí)SI值最高,比對(duì)照組增長了18.8%(p<0.01),之后繼續(xù)增加樣品濃度SI值開始降低,在400μg/mL時(shí)促進(jìn)作用消失,導(dǎo)致這一結(jié)果的原因需進(jìn)一步研究。VAWP-APH在≥50μg/mL時(shí)對(duì)脾細(xì)胞增殖呈明顯促進(jìn)作用,在濃度為100μg/mL時(shí)SI值達(dá)到最高,比對(duì)照組增長了12.3%(p<0.01)。SPI-APH對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖無顯著影響,而SPI-SGD對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖呈輕微抑制作用,在濃度為100μg/mL時(shí)SI值降低最高達(dá)12.0%。ConA是T淋巴細(xì)胞的有絲分裂原,可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化,進(jìn)而使細(xì)胞因子合成、細(xì)胞因子受體表達(dá)、細(xì)胞分化及細(xì)胞增殖等變化。機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量越大,增殖活性越高,機(jī)體由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能越強(qiáng)[15]。本研究中VAWP-SGD和VAWP-APH對(duì)小鼠脾T細(xì)胞增殖在不同程度上均有促進(jìn)作用,表示其具有免疫調(diào)節(jié)活性促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答,其中VAWP-SGD作用更明顯。而SPI-SGD對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖呈抑制作用,發(fā)生該現(xiàn)象的機(jī)理有待進(jìn)一步探討,可能是樣品影響了細(xì)胞對(duì)ConA的敏感性或是樣品預(yù)先結(jié)合了細(xì)胞上ConA的受體從而使其失去了刺激細(xì)胞的作用。

上文例(1)這樣的句子屬于典型的敘事語體句，符合上面列出的要求；而在《駱駝祥子》中的另一段，則屬于非典型的敘事語體句：

圖4 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分 對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on ConA-stimulated proliferation of murine splenocytes

LPS是一種非胸腺依賴性抗原,不需要輔助性T淋巴細(xì)胞的作用,可直接刺激B淋巴細(xì)胞增殖分化為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞,并分泌IgM等抗體,發(fā)揮體液免疫的功能[16]。圖5表明,在濃度≥0.5μg/mL時(shí),VAWP-SGD可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴B細(xì)胞增殖,在濃度為100μg/mL時(shí)SI值達(dá)到最高,比對(duì)照組增加17.2%(p<0.01)。而VAWP-APH呈現(xiàn)顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖的作用,SI值最高增長11.40%(p<0.01)。SPI-SGD對(duì)小鼠脾淋巴B細(xì)胞的促進(jìn)作用隨濃度增大呈先增加后減小的趨勢,在50μg/mL時(shí)SI最高達(dá)到1.648,增長了9.26%。SPI-APH在濃度為100～400μg/mL時(shí)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(p<0.01),在100μg/mL時(shí)最高增長11.26%。由此可見,隨樣品濃度變化,幾種<3ku的肽段組分對(duì)小鼠脾淋巴B細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用,但作用趨勢明顯不同,其中VAWP-SGD促進(jìn)作用最強(qiáng),其次是VAWP-APH。

圖5 不同蛋白酶解物分子量<3ku組分 對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.5 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on LPS-stimulated proliferation of murine splenocytes

上述結(jié)果表明,不同蛋白酶解物<3ku組分對(duì)脾細(xì)胞增殖影響有顯著差異。不同源蛋白的氨基酸組成差異可能是超濾所得肽段影響小鼠脾細(xì)胞增殖的主要因素之一。此外,蛋白酶種類也是重要影響因素。蛋白中含有許多生物活性序列,其中包括免疫活性肽,它以無活性的形式存在于蛋白前體物中,只有用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆獬鰜砗?才能成為具有生理活性的肽段[17]。免疫活性肽通常含有堿性氨基酸[18],模擬胃腸消化中胃蛋白酶主要水解苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸組成的肽鍵促進(jìn)水溶性蛋白質(zhì)水解成為多肽,胰酶能夠特異性地切斷賴氨酸和精氨酸結(jié)合的位點(diǎn)產(chǎn)生富含堿性氨基酸的肽段,暴露出可能具有免疫調(diào)節(jié)活性的肽段。堿性蛋白酶作為一種非特異性內(nèi)切酶主要作用于含疏水性羧基的肽鍵,可隨機(jī)產(chǎn)生大量的小分子肽段,使蛋白質(zhì)充分水解[19-22]。總的來說,鹿茸蛋白模擬胃腸消化物中<3ku組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖影響最大,其具有較顯著的免疫調(diào)節(jié)活性,對(duì)繼續(xù)開發(fā)鹿茸產(chǎn)品和免疫活性肽具有重要意義。

3 結(jié)論

本研究主要針對(duì)鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白,通過模擬胃腸消化和堿性蛋白酶水解獲得不同蛋白酶解物,經(jīng)超濾分離制備不同蛋白酶解物<3ku組分,采用脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)探討各組分免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果表明,鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白模擬胃腸消化的時(shí)間為胃蛋白酶2h+胰酶5h,堿性蛋白酶水解時(shí)間為4h。經(jīng)模擬胃腸消化的鹿茸水溶性蛋白和大豆分離蛋白游離氨基含量更高,水解度更大。經(jīng)超濾分離所得分子量<3ku的各組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖影響差異顯著。其中,鹿茸水溶性蛋白模擬胃腸消化物<3ku組分對(duì)未經(jīng)誘導(dǎo)、ConA和LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng),具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。此結(jié)果表明蛋白質(zhì)來源和蛋白酶種類均對(duì)酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性有一定影響,而蛋白質(zhì)種類影響更大。本研究為進(jìn)一步研究開發(fā)鹿茸產(chǎn)品和免疫活性肽提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。鹿茸水溶性蛋白經(jīng)模擬胃腸消化后釋放出的生物活性肽的氨基酸組成、肽序及其作用機(jī)制仍然未知,可為下一步研究提供方向。

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Preparation of 3ku ultrafiltration fractions from velvet antler and soybean protein hydrolysates and their effect on murine splenocytes proliferation

ZHAO Lei,WANG Xuan,XIE Qiao-fei,LI Si-ran,WU Di,NI Chang-zheng

(Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Velvet antler water-soluble protein(VAWP)and soybean protein isolate(SPI)were hydrolyzed byinvitrosimulated gastrointestinal digestion and Alcalase to obtain different protein hydrolysates. The hydrolysis time was optimized according to the changes in the content of α-NH2. The<3ku fractions of velvet antler water-soluble protein simulated gastrointestinal digest(VAWP-SGD),velvet antler water-soluble protein Alcalase hydrolysate(VAWP-APH),soybean protein isolate simulated gastrointestinal digest(SPI-SGD)and soybean protein isolate Alcalase hydrolysate(SPI-APH)were fractionated by ultrafiltration. The effect of<3ku fractions on the proliferation of murine splenocytes were studied. Results indicated that the hydrolysis time ofinvitrosimulated gastrointestinal digestion were 2h with pepsin and 5h with pancreatin. The hydrolysis time by Alcalase was 4h. VAWP-SGD and SPI-SGD significantly promoted the proliferation of resting murine splenocytes(≥100μg/mL). VAWP-SGD showed the highest stimulated effect on ConA-stimulated murine splenocytes proliferation,followed by VAWP-APH. SPI-APH had no obvious effect on ConA-stimulated murine splenocytes proliferation,whereas SPI-SGD inhibited the proliferation of ConA-stimulated murine splenocytes. VAWP-SGD also had the strongest stimulated effect on LPS-stimulated murine splenocytes proliferation,followed by VAWP-APH,SPI-APH,and then was SPI-SGD. The above results showed that VAWP-SGD had the strongest stimulated effect on the proliferation of murine splenocytes,which suggested that VAWP-SGD was of great significance for the development of antler products and immune active peptide.

VAWP;SPI;invitrosimulated gastrointestinal digestion;Alcalase;murine splenocytes

2014-09-02

趙磊(1982-)，女，博士，副教授，主要從事功能性食品研究。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31201324)；大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(SJ201402064)；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201210011008) 。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0342-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.061