P53蛋白參與靈芝酸抑制癌細胞增殖的過程

唐 文,吳 穎,王雨薔,孫培龍,歐陽晶晶

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院 食品系，上海 201418；2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418)

P53蛋白參與靈芝酸抑制癌細胞增殖的過程

唐 文1,吳 穎2,王雨薔1,孫培龍1,歐陽晶晶1

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院 食品系，上海 201418；2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418)

通過對靈芝三萜類物質(zhì)(靈芝酸T)抑制肺癌H1299(p53-/-)細胞、肺癌95-D(p53+/+)細胞增殖實驗,考察了P53蛋白對靈芝酸抑制增殖作用的影響。結(jié)果表明:通過比較IC50,表達野生型P53蛋白的95-D細胞比不表達P53蛋白的H1299細胞對靈芝酸T的敏感性高3.3倍。P53抑制劑Pifithrin-α與靈芝酸T聯(lián)合處理能顯著地降低靈芝酸T對95-D細胞增殖的抑制率(p<0.05)。進一步研究表明靈芝酸T可誘導(dǎo)95-D(p53+/+)中P53蛋白表達,并促進細胞凋亡。以上結(jié)果提示P53蛋白參與了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖的過程,可能是靈芝三萜類物質(zhì)抗腫瘤的作用靶點。本研究可為開發(fā)輔助抑制腫瘤類保健食品研究提供理論基礎(chǔ)。

靈芝酸T,P53蛋白,增殖抑制,保健食品

靈芝(Ganodermalucidum)是一種傳統(tǒng)的藥用真菌,《中華人民共和國藥典》收錄了靈芝作為法定中藥材[1],2001年靈芝被列入《可用于保健食品的真菌菌種名單》。截止到2013年,國內(nèi)已注冊近600種靈芝類保健食品,其中64%具有免疫調(diào)節(jié)作用,6%具有護肝作用,4%具有輔助抑制腫瘤作用(基于對中國國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)中靈芝保健品公開信息的統(tǒng)計分析),保健功能主要集中在免疫調(diào)節(jié)功能上,需要在靈芝保健功能研究方面加以拓展和深化。同時,隨著生活方式、環(huán)境條件及人口老齡化等影響腫瘤發(fā)生發(fā)展因素的改變,自20世紀70年代以來,我國癌癥呈明顯上升趨勢,現(xiàn)已成為城、鄉(xiāng)居民的首要死因,其中肺癌的上升趨勢尤為明顯[2]。因此,研究靈芝輔助抑制腫瘤保健功能具有一定的理論和實際意義。

三萜類化合物(如靈芝酸類)是靈芝中重要活性物質(zhì)之一[3-4]。自Toth O等[5]報道靈芝三萜類化合物的抗癌活性以來,多種靈芝酸被證實具有抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移功能[6-7]。本課題組前期研究表明靈芝酸誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的途徑是依賴于線粒體的內(nèi)源性凋亡途徑[8],P53蛋白在靈芝酸抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用[9]。但P53蛋白是否參與靈芝酸抑制腫瘤細胞增殖的過程還未見報道。

本研究擬采用表達p53基因的95-D肺癌細胞和p53基因缺失的H1299肺癌細胞,通過研究靈芝酸T抑制兩種細胞增殖效果的差異,分析P53蛋白在靈芝酸抗癌細胞增殖過程中的作用,研究結(jié)果將為開發(fā)功能因子明確的具有輔助抑制腫瘤作用的保健食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

細胞株:H1299(人非小細胞肺癌細胞,p53-/-)和95-D(人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞,p53+/+) 購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心;靈芝酸T(純度>99%)從赤芝(Ganoderma lucidum)子實體中經(jīng)制備色譜分離提取,經(jīng)核磁譜圖與標準品比對鑒定,以DMSO(二甲亞砜)溶解備用。噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)、Pifithrin-α-hydrobromide(Pifithrin-α)、RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、凋亡分析試劑盒 購于華美生物技術(shù)有限公司;鼠抗人p53單克隆抗體(即用型)、DAB顯色試劑盒 購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

酶標儀Bio-Rad,USA;CO2培養(yǎng)箱Heraeus,USA;流式細胞儀BD Bioscience,USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 H1299和95-D細胞采用常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基,青霉素和鏈霉素雙抗,10%小牛血清,37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)和繼代。

1.2.2 抑制細胞增殖能力的測定 分別取對數(shù)生長期細胞1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔0.2mL,6h貼壁后分別加入不同終濃度(8.5,10,25,50μg/mL等)的靈芝酸T溶液處理,對照組加等量體積的溶劑。置37℃,5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,實驗終止前4h每孔加入5μg/mL MTT 10μL,培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.04mol/L DMSO 200μL,振蕩保溫15min,待MTT還原產(chǎn)物完全溶解,酶標儀以570nm為分析波長,測定吸光度。通過計算得到抑制率:抑制率(%)=(處理組吸光度的平均值/對照組吸光度的平均值)×100。獨立進行3次實驗。每次實驗重復(fù)6次,取平均值[8]。

1.2.3 凋亡分析 對數(shù)生長期95-D細胞培養(yǎng)4h后,經(jīng)各種濃度的藥物作用特定的時間后,經(jīng)胰蛋白酶消化,離心收集細胞(1500r/min × 10min),PBS 洗滌兩遍,以PBS調(diào)整細胞濃度為106個/mL,加入RNase,終濃度為100U/mL,37℃保溫30min,加入Annexin V和PI,終濃度為50μg/mL,在常溫下暗反應(yīng)30min,然后200目濾膜過濾,經(jīng)流式細胞儀分析凋亡,每次記錄1000～1500個細胞。

1.2.4 P53蛋白的western blotting分析 Western blotting分析P53蛋白,方法完全按照參考文獻[8]的流程操作。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行顯著差異性分析,在*p<0.05水平和**p<0.01水平下判斷其顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝酸T抑制95-D和H1299細胞增殖效果的差異

通過比較靈芝酸T抑制H1299(人肺癌細胞,p53-/-)、95-D(人肺癌細胞,p53+/+)細胞增殖效果,考察P53 蛋白是否對抑制過程有影響。圖1表明靈芝酸T對95-D和H1299肺癌細胞增殖均具有抑制能力,表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。表達P53 蛋白95-D細胞的生長被明顯地抑制,與之相比,不表達P53 蛋白的H1299細胞對靈芝酸T敏感性較低。靈芝酸T對95-D肺癌細胞的IC50為24.5μg/mL,對H1299肺癌細胞的IC50的理論計算值是80μg/mL,約是95-D的3.3倍。50μg/mL的靈芝酸T處理可抑制78%的95-D細胞增殖,而對H1299細胞的抑制率只有31%。以上結(jié)果表明:靈芝酸T劑量依賴性地抑制95-D和H1299細胞增殖,且對95-D細胞更敏感。95-D細胞是表達P53蛋白的腫瘤細胞,因此,可以推測P53蛋白可能參與了靈芝酸T抑制細胞增殖的過程。

圖1 靈芝酸T對H1299和95-D細胞的細胞毒性Fig.1 The cytotoxicity of ganoderic acid T on H1299和95-D cells

圖2表明靈芝酸T處理時間對95-D和H1299細胞增殖過程的影響,根據(jù)圖1結(jié)果計算出兩種細胞的半數(shù)致死濃度為24.5、80μg/mL,做為靈芝酸T處理濃度。結(jié)果表明在高濃度(80μg/mL)條件下,靈芝酸T對95-D和H1299細胞增殖的影響在25h之前有極其顯著地差異(p<0.01),對95-D細胞的抑制率顯著地高于對H1299細胞的抑制率。相同濃度(80μg/mL)下,靈芝酸T對95-D細胞在實驗5h即表現(xiàn)出很強的抑制率,達到76%;而H1299細胞在后期才表現(xiàn)出相同的抑制率。在較低濃度(25μg/mL)條件下,靈芝酸T對95-D和H1299細胞增殖的影響在實驗前期(19h之前)差異不顯著,而在實驗后期(19h以后)表現(xiàn)出顯著差異(p<0.05),95-D細胞增殖抑制率顯著高于H1299細胞增殖抑制率。

圖2 靈芝酸T處理時間對H1299 和95-D細胞增殖的影響Fig.2 The time course of the cytotoxicity of ganoderic acid T on H1299和95-D cells

以上結(jié)果表明:不表達P53 蛋白的H1299細胞對靈芝酸T處理的抑制反應(yīng)要比表達的95-D細胞延遲和降低,提示P53 蛋白參與了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖的過程。

2.2 P53抑制劑Pifithrin-α抑制了靈芝酸T對95-D細胞的細胞毒性

為了確證P53蛋白參與了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖的過程,選擇P53抑制劑進行比較研究。Pifithrin-α是一種常用的P53抑制劑,能可逆地抑制P53依賴的基因轉(zhuǎn)錄激活[10]。圖3表明,Pifithrin-α對95-D細胞具有一定的細胞毒性,但在低于5μmol/L濃度下對95-D細胞的毒性很小(抑制率低于2.5%),因此選擇5μmol/L作為下一步實驗的處理濃度。

圖3 Pifithrin-α對95-D細胞的細胞毒性Fig.3 The cytotoxicity of Pifithrin-α on 95-D cells

添加5μmol/L P53抑制劑Pifithrin-α后,不同濃度靈芝酸T抑制95-D細胞增殖的效果顯著下降,10,25μg/mL處理組和對照組間抑制率有顯著性差異(p<0.01)。而H1299細胞因為不表達P53蛋白,Pifithrin-α對靈芝酸T抑制其增殖沒有影響(數(shù)據(jù)未列出)。圖4結(jié)果表明:P53蛋白參與介導(dǎo)了靈芝酸T抑制肺癌細胞95-D增殖的過程。但50μg/mL處理組差異不顯著,提示在較高濃度下,靈芝酸T可能還有其他的不依賴于P53調(diào)節(jié)的抑制癌細胞增殖的途徑[8],因此對p53基因野生型和缺陷型細胞都具有較大的毒性。

圖4 Pifithrin-α和靈酸T聯(lián)合用 對95-D細胞增殖的影響Fig.4 The cytotoxicity of Pifithrin-α and Ganoderic acid T on 95-D cells

2.3 靈芝酸T處理增加了細胞內(nèi)P53蛋白的表達量并誘導(dǎo)95-D細胞凋亡并

靈芝酸T(50μg/mL)分別處理95-D細胞0,4,8h后收集細胞,進行P53蛋白的western blotting分析,結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明靈芝酸T可誘導(dǎo)95-D細胞內(nèi)P53蛋白表達量增加,具有時間依賴性。以上結(jié)果表明:在靈芝酸T抑制細胞增殖過程中,P53蛋白參與了這個過程。

圖5 靈芝酸T誘導(dǎo)95-D細胞P53蛋白的表達Fig.5 Ganoderic acid T induced the accumulation of P53 protein in 95-D cells

靈芝酸T(50μg/mL)分別處理95-D細胞0,4,8h后進行流式細胞術(shù)分析。結(jié)果表明靈芝酸T可誘導(dǎo)95-D細胞的凋亡,且隨著處理時間增加凋亡率逐漸增加。靈芝酸T(50μg/mL)處理8h后,總凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)可達到69%。P53蛋白是細胞生長的負調(diào)控因子,可通過誘導(dǎo)凋亡抑制癌細胞增殖,圖5、圖6數(shù)據(jù)顯示隨著P53蛋白表達量的增加,癌細胞總凋亡率增加。

圖6 靈芝酸T誘導(dǎo)95-D細胞凋亡Fig.6 Ganoderic acid T induced the apoptosis of 95-D cells注:A：0h；B：4h；C：8h。

P53蛋白是一種53ku的核內(nèi)磷酸化蛋白,是細胞生長的負調(diào)控因子。以上數(shù)據(jù)表明較低濃度靈芝酸T可以刺激95-D腫瘤細胞內(nèi)野生型P53蛋白表達,進而誘導(dǎo)凋亡并抑制細胞增殖。同時較高濃度靈芝酸T有直接的細胞毒性,對不表達P53蛋白的癌細胞也具有抑制增殖能力。雖然進一步的調(diào)控機制有待深入研究,但現(xiàn)有數(shù)據(jù)已證明靈芝酸T通過誘導(dǎo)P53蛋白表達和凋亡進而抑制腫瘤細胞增殖。結(jié)合我們前期的靈芝酸增敏增效作用研究[2],提示靈芝酸具有輔助抑制腫瘤作用。

3 結(jié)論與討論

靈芝酸T對H1299肺癌細胞的細胞毒性要明顯地低于對95-D肺癌細胞的細胞毒性,這兩種細胞的主要差異體現(xiàn)在P53蛋白表達上,H1299肺癌細胞為p53基因缺失型,不表達P53蛋白[11]。95-D肺癌細胞可表達野生型P53蛋白[7]。添加p53抑制劑后,靈芝酸T抑制95-D細胞增殖的能力顯著下降。Western blotting 分析表明,靈芝酸T處理提高了95-D細胞內(nèi)P53蛋白的表達量并誘導(dǎo)癌細胞凋亡。以上結(jié)論表明:靈芝酸處理95-D細胞會刺激P53蛋白的表達,P53蛋白介導(dǎo)了靈芝酸T抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的過程。P53蛋白或p53基因可能是靈芝酸發(fā)揮抗癌作用的靶點之一。以上結(jié)論對于靈芝保健食品研究具有一定的意義。

我國是保健食品生產(chǎn)和消費大國,但保健食品行業(yè)創(chuàng)新水平參差不齊,技術(shù)創(chuàng)新率總體偏低。第三代保健食品的研發(fā)尚處于起步階段。在已注冊的近600種靈芝類保健食品中,主成分為粗多糖的產(chǎn)品占39%,主成分為三萜粗提物的產(chǎn)品占31%,主成分為粗多糖和三萜粗提物混合物的產(chǎn)品占12%,未標注主成分的產(chǎn)品占18%。特別是所有產(chǎn)品均未標注具體的組成成分及各成分比例,導(dǎo)致功效成分不準確,產(chǎn)品質(zhì)量控制標準不清晰、作用機制不明確等問題的出現(xiàn)。因此,迫切需要確切功效和特定成分之間的對應(yīng)關(guān)系研究。

我國中藥材品種豐富,且有長期的臨床使用實踐,是保健食品研制的有效物質(zhì)和重要理論來源。因此,充分利用這些優(yōu)勢,結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究技術(shù),提升保健食品的品質(zhì)和功能,對發(fā)展有中國特色的保健食品具有重要的意義。

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Inhibition of ganoderic acid mediated by P53 protein on cancer cells proliferation

TANG Wen1,WU Ying2,WANG Yu-qiang1,SUN Pei-long1,OUYANG Jing-jing1

(1.Department of Food Science and Technology,School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,Chin;2.School of Chemical and Environmental Engineering,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China)

The roles of P53 protein in the inhibitory effect of ganoderic acid T(GA-T)on human lung cancer cells proliferation were evaluated by H1299(p53-/-)and 95-D(p53+/+)cells. The results showed that 95-D cell which expressed P53 protein was more sensitive to the GA-T than H1299 cell which unexpressed P53 protein. The cytotoxicity of GA-T on 95-D cells was 3.3 times higher than that of H1299 cell significantly. The cytotoxicity of GA-T on 95-D cancer cells decreased significantly after pifithrin-α treatment(p<0.05). Furthermore,GA-T stimulated the expression of P53 in 95-D cancer cells and induced the apoptosis of 95-D cancer cells dose-dependently. The results mentioned above proved that P53 participated in the process of anti-proliferation of cancer cell by GA-T and should be a potent target of ganoderic acids. The results in this paper should provide the theoretical foundation for development of functional food.

ganoderic acid T;P53 protein;anti-proliferation;function food

2014-05-04

唐文(1970-),男，博士,副教授,研究方向:食品生物技術(shù)、生化藥理學(xué)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0193-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.030