不同貯藏時(shí)間的蓮子蛋白質(zhì)提取及其理化特性研究

劉星星，杜雨芊，黃學(xué)勇，羅火林，方菲菲，羅麗萍，*

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330031；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，江西南昌 330038)

不同貯藏時(shí)間的蓮子蛋白質(zhì)提取及其理化特性研究

劉星星1，杜雨芊2，黃學(xué)勇1，羅火林1，方菲菲1，羅麗萍1，*

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江西省植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330031；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，江西南昌 330038)

為研究蓮子在陳化過(guò)程中蛋白質(zhì)變化規(guī)律,本文首先通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)蓮子蛋白質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,再利用優(yōu)化的條件,分別以不同貯藏時(shí)間的蓮子為材料,提取獲得蓮子蛋白。采用SDS-PAGE電泳和氨基酸分析儀,研究提取蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量(Mr)組成及氨基酸組成。結(jié)果表明:蓮子蛋白的優(yōu)化提取條件為:pH11,料液比1∶30,提取時(shí)間2h,提取率達(dá)60.11%;隨著貯藏時(shí)間的增加,蓮子蛋白組成發(fā)生了一定變化,Mr在26～43ku的蛋白質(zhì)含量逐漸變少;當(dāng)年蓮子蛋白的總氨基酸含量最高,但隨著陳化過(guò)程的進(jìn)行,含硫氨基酸中蛋氨酸含量下降。貯藏過(guò)程中蓮子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等的變化是蓮子陳化的主要原因之一。

蓮子,陳化,SDS-PAGE,氨基酸

蓮(NelumbonuciferaGaertn.)是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物,是特種宿根經(jīng)濟(jì)植物,也是我國(guó)重要的優(yōu)質(zhì)特產(chǎn)資源[1]。蓮子營(yíng)養(yǎng)十分豐富,含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、生物堿及微量營(yíng)養(yǎng)素[2-4],是一種老少皆宜的食療佳品及著名的藥食同源食物。

干蓮子中含有約25%的蛋白質(zhì)。早期研究表明蛋白質(zhì)的變化并不是影響陳化大米品質(zhì)的主要因素[5],因?yàn)樵趦?chǔ)藏過(guò)程中,大米總蛋白質(zhì)含量基本不變。但后來(lái)發(fā)現(xiàn),陳化過(guò)程中,雖然總蛋白質(zhì)含量基本不變,但是其內(nèi)在結(jié)構(gòu)和功能特性方面發(fā)生一定的變化,比如二硫鍵的交聯(lián)作用使得小分子量蛋白質(zhì)形成大分子量蛋白質(zhì),而大分子量的蛋白質(zhì)又易與淀粉結(jié)合形成復(fù)合物,影響谷物的糊化特性[6-7]。大米在陳化過(guò)程中,游離氨基酸的含量也會(huì)發(fā)生變化,比如親水氨基酸(天冬氨酸)含量會(huì)下降,疏水氨基酸(丙氨酸)含量上升,含硫氨基酸中蛋氨酸含量下降。稻谷在貯藏過(guò)程中,由于疏水基團(tuán)的暴露,親水氨基酸的減少,使得蛋白質(zhì)溶解性下降[8]。蔡聯(lián)輝等[9]發(fā)現(xiàn)氨基酸組成對(duì)蓮子的品質(zhì)有著較大的影響,同時(shí)也是蓮子營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)。

目前,國(guó)外對(duì)蓮子的研究主要集中在形態(tài)解剖及提取物的抗氧作用[10]及抗性淀粉的結(jié)晶性能[11]。國(guó)內(nèi)有關(guān)于蓮子主要成分的測(cè)定和提取、蓮子營(yíng)養(yǎng)和功效成分、食品加工及育種等方面的研究報(bào)道[4,12-13],也有對(duì)其蛋白質(zhì)及功能特性進(jìn)行研究[14]。課題組對(duì)比了不同貯藏時(shí)間蓮子的化學(xué)成分和功能特性變化,主要涉及直鏈、支鏈淀粉含量和淀粉顆粒、脂類氧化水解、蛋白質(zhì)巰基交聯(lián)形成二硫鍵等的變化,由此引發(fā)的協(xié)同作用導(dǎo)致淀粉顆粒不易糊化,造成蓮子蒸煮品質(zhì)下降的研究[15]。但是將蓮子蛋白質(zhì)單獨(dú)提取出來(lái),并研究其與陳化機(jī)理的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。本文以不同貯藏時(shí)間的蓮子為材料,利用優(yōu)化的條件提取獲得其蛋白質(zhì),測(cè)定了蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量、氨基酸組成及含量,并探討了蓮子在陳化過(guò)程中蛋白質(zhì)組成變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮子:由江西省廣昌縣白蓮科學(xué)研究所提供,品種為“太空蓮3號(hào)”。當(dāng)年蓮子為2013年8月收獲,陳年蓮子分別是2012年(貯藏一年)、2011年(貯藏兩年)、2010年(貯藏三年)、2009年(貯藏四年)、2008年(貯藏五年)收獲,均產(chǎn)于廣昌縣白蓮科學(xué)研究所基地,經(jīng)去種皮、胚芽,烘干后真空包裝。分別將6個(gè)年份蓮子經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩,4℃冷藏備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2013年9～11月。

Tris-HCl,巰基乙醇,4mol/L氫氧化鈉,1mol/L鹽酸,5×SDS-PAGE Loading buffer,30%丙烯酰胺混合溶液,10% AP(過(guò)硫酸銨),10% SDS,染色液,脫色液,0.1%的SDS溶液。以上試劑均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺):電泳級(jí)生化試劑;彩色預(yù)染蛋白Marker(10～170ku:英特生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醚、甲醇、冰醋酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Easy Chem Plus型全自動(dòng)離子分析儀 北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司;Hitachi L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;Thermo orion 410A+型pH計(jì) 美國(guó)奧立龍公司;HY-4型調(diào)速多用振蕩器 國(guó)華電器有限公司;1600型離心機(jī) 上海力康儀器有限公司;DRC-1000型凍干機(jī) 上海茸研儀器有限公司;752C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠;JA1003N型電子分析天平 上海市精密科學(xué)儀器有限公司;RH-KT/C型磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蓮子蛋白質(zhì)提取條件優(yōu)化及制備 采用堿提酸沉法[16]。準(zhǔn)確稱取20g干燥脫脂蓮子粉,按照一定料液比加入不同pH堿溶液,恒溫水浴振蕩提取后,3500r/min離心15min,收集上清液,1mol/L鹽酸將其pH調(diào)至4.5,進(jìn)行酸沉蛋白操作,然后在4℃的冰箱中靜置過(guò)夜,收集酸沉蛋白沉淀,經(jīng)去離子水洗滌后凍干。凍干粉置于-20℃的冰箱中備用,采用全自動(dòng)離子分析儀測(cè)定其總含氮量,以N×6.25為粗蛋白的含量。

蓮子蛋白提取率(%)=(上清液蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料蓮子粉中的總蛋白質(zhì)質(zhì)量)×100。

選定提取液pH、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素作單因素實(shí)驗(yàn)[17],考察各單因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。在單因素的基礎(chǔ)上,采用L9(33)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9(33)正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 L9(33)Factors and levels of the orthogonal test

1.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳 分別稱取各年蓮子蛋白凍干粉2mg,加入50μL的1×Loading buffer,煮沸5min,11000×g離心20min后,取20μL上清點(diǎn)樣,采用5%濃縮膠及12%分離膠進(jìn)行垂直平板電泳分析,蛋白質(zhì)質(zhì)量運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行分析[18]。

1.2.3 氨基酸組成分析 分別稱取各年蛋白質(zhì)凍干粉各0.1g于試管中,加入10mL 6mol/L的HCl溶液,封口后放入消煮爐中,110℃水解24h,冷卻后用蒸餾水定容至50mL,搖勻后用0.45μL的水相濾頭過(guò)濾200μL至大口離心管中,放入60℃的烘箱里濃縮至無(wú)液體,然后加入1mL 0.02mol/L的HCl溶解,靜置30min后,采用氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸含量(除色氨酸)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子蛋白質(zhì)提取條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取提取液pH(A)、料液比(B)、時(shí)間(C)3個(gè)因素,按L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從表2可知,影響蓮子蛋白提取率的因素依次為:A>B>C。最佳提取條件組合為A3B2C2,即pH11、料液比1∶30、提取時(shí)間2h。由于該組合在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn),所以追加實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證。經(jīng)驗(yàn)證可知,在A3B2C2條件下,蓮子蛋白的提取率達(dá)60.11%。根據(jù)資料[14]顯示,蓮子蛋白的組分包括醇溶、水溶、鹽溶、酸溶和堿溶蛋白。其中鹽溶蛋白占總蛋白的7.64%,而堿提酸沉法沒(méi)有涉及加鹽提取,因此優(yōu)化提取液、料液比和提取時(shí)間水平條件后,本實(shí)驗(yàn)提取率仍然不高。蔡聯(lián)輝等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)蓮子殘?jiān)鞍字饕且恍┓堑鞍谆旌衔?、不可溶性蛋白質(zhì)組分和混溶蛋白。

2.2 蓮子蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳

由圖1 a可知,蓮子蛋白Mr主要集中在10～26、34～55和95～130ku之間。直觀觀察可見(jiàn)不同貯藏時(shí)間蓮子蛋白電泳條帶的強(qiáng)弱存在較大差異,尤其是Mr在26～43ku的蛋白質(zhì)含量逐漸變少,但難以發(fā)現(xiàn)條帶數(shù)目的差異。根據(jù)相關(guān)資料[14-15,21],圖1a中,相對(duì)分子量在95～130ku之間的條帶應(yīng)該是球蛋白,而在10～55ku可能有球蛋白、谷蛋白和酸溶蛋白。張旻等[15]發(fā)現(xiàn)蓮子中清蛋白、谷蛋白和酸溶蛋白含量較少,球蛋白含量最高。球蛋白含有較高的酸性氨基酸和疏水性氨基酸,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)變性后其空間構(gòu)象也會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致這兩種氨基酸外露,影響其功能特性并加劇蛋白質(zhì)變性。圖譜中輕微拖尾現(xiàn)象可能是醇溶蛋白和谷蛋白會(huì)發(fā)生交融,產(chǎn)生的混溶蛋白導(dǎo)致[20];另一方面,在樣品處理過(guò)程中,多余的脂肪未處理完全。進(jìn)一步運(yùn)用Quantity One軟件(圖1b)進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別,發(fā)現(xiàn)2013(當(dāng)年)、2012(貯藏1年)、2011(貯藏2年)、2010(貯藏3年)、2009(貯藏4年)和2008(貯藏5年)年蓮子蛋白分別具有18、17、17、16、16、13條條帶,條帶的粗細(xì)與吸光值成正比,條帶越粗,該段蛋白含量也越多。以當(dāng)年蓮子為參考比對(duì)相似度發(fā)現(xiàn),隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),相似度分別為34.2%,33.1%,25.9%,25.2%,9.5%,總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且以貯藏5年的蓮子相似度最低。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Schedule and results of orthogonal test

圖1 不同年份蓮子蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖(a) 和Quantity One軟件分析圖(b)Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis(a) and Quantity One software analysis chart of proteins(b) in different years lotus seeds

2.3 蓮子蛋白中氨基酸含量的分析

不同貯藏時(shí)間蓮子蛋白氨基酸測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。從蓮子蛋白中共檢出了17種氨基酸,不同年份蓮子蛋白氨基酸總量分別是4.436,3.749,4.240,3.766,4.331、4.106mmol/L,當(dāng)年蓮子蛋白中總氨基酸含量最多;其中必需氨基酸總量分別為0.863,0.740,0.843,0.719,0.812,0.794mmol/L。必需氨基酸和非必需氨基酸總量隨著貯藏年份的增加變化趨勢(shì)不明顯。選用FAO/WHO成人推薦值對(duì)蓮子蛋白質(zhì)必需氨基酸進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同貯藏時(shí)間蓮子蛋白中的蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FAO/WHO的推薦值。異亮氨酸的含量分別是1.32%、1.02%、1.14%、1.27%、1.36%和1.26%,近似或超過(guò)FAO/WHO的推薦值。相較其它谷物而言,蓮子含有豐富的賴氨酸,故蓮子可平衡谷類營(yíng)養(yǎng)的不足,提高蛋白質(zhì)的生物效用。

表3 不同貯藏時(shí)間蓮子蛋白質(zhì)氨基酸組成Table 3 Amino acids analysis in protein of lotus seeds

注:2013年、2012年、2011年、2010年、2009年和2008年分別代表當(dāng)年、貯藏1、2、3、4、5年。同列不同字母表示顯著差異(p<0.05)?！?* ”代表必需氨基酸。

3 結(jié)論

本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化了蓮子蛋白質(zhì)提取條件,在pH11,料液比1∶30,提取時(shí)間2h時(shí),提取率最大達(dá)60.11%,并將其應(yīng)用于不同貯藏時(shí)間蓮子蛋白質(zhì)的提取。對(duì)提取的蓮子蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳及氨基酸分析。研究結(jié)果表明,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加,蓮子蛋白組成在貯藏過(guò)程中發(fā)生了一定變化,Mr在26～43ku的蛋白質(zhì)含量逐漸變少;當(dāng)年蓮子蛋白的總氨基酸含量最高,隨著陳化的過(guò)程,含硫氨基酸中的蛋氨酸含量下降。研究結(jié)果對(duì)于明確蛋白質(zhì)組分變化對(duì)蓮子質(zhì)構(gòu)特性的影響,以及闡明蓮子的陳化機(jī)理具有積極意義。

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Extraction and physico-chemical properties of protein from lotus seeds with different storage times

LIU Xing-xing1,DU Yu-qian2,HUANG Xue-yong1,LUO Huo-lin1,FANG Fei-fei1,LUO Li-ping1,*

(1.School of Life Science,Key Laboratory of Plant Resources in Jiangxi Province,Nanchang University,Nanchang 330031,China;2.Food and Cosmetics Supervision,Nanchang 330038,China)

Lotus seed is easy to aging during storage. To investigate the variation of the protein in aging process,lotus seeds with different storage times were as material for this study. After optimizing the protein extraction conditions by orthogonal experiment,the lotus seeds protein was obtained,and its Mr and amino acid constituents were researched by using SDS-PAGE electrophoresis and Amino Acid Automatic Analyzer,respectively. The results showed that the optimum extraction condition were pH11,solid-liquid ratio 1∶30,and extraction time 2h,the extraction rate was 60.11%. With the extension of storage time,the protein content with Mr 26～43ku reduced gradually. The total amino acid content was highest in the fresh lotus seeds,but as the aging process,the content of methionine which is one of sulphur-containing amino acid was decreased. The lotus seeds protein changed during storage,which is one of the main reasons of aging.

lotus seeds;aging;SDS-PAGE;amino acid analysis

2014-09-03

劉星星(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：植物資源與系統(tǒng)植物學(xué)。

*通訊作者:羅麗萍(1972-)，女，博士，教授，研究方向：食物資源開(kāi)發(fā)與利用。

江西省科技廳(20123BCB22004)；江西省教育廳(KJLD12051)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0058-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.003