妊娠期糖尿病患者和正常孕婦在不同孕周中血清及新生兒臍血中視黃醇結(jié)合蛋白4的含量變化*

孫霞 韓淑娟 紀(jì)向虹 王茜

視黃醇結(jié)合蛋白4（Retinol binding protein，RBP4）是2005年首先由美國(guó)學(xué)者Yang等[1]最新發(fā)現(xiàn)的由肝臟、脂肪細(xì)胞分泌的與肥胖有關(guān)的脂肪細(xì)胞因子（adipokine），RBP4是一種血漿視黃醇結(jié)合蛋白，是全反式視黃醇即維生素A的運(yùn)載蛋白，其主要功能是進(jìn)行維生素A的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝。在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，視黃醇結(jié)合蛋白與視黃醇、甲狀腺素運(yùn)載蛋白形成三聚體，將視黃醇運(yùn)送至體內(nèi)特定的靶組織和器官，發(fā)揮其主要作用，臨床已用血清RBP4水平變化來(lái)早期診斷肝腎疾病。近年來(lái)已有研究表明，RBP4與胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切，但RBP4水平在GDM孕婦血清中的變化有不同結(jié)論[2]。能否通過(guò)控制RBP4水平來(lái)干預(yù)GDM發(fā)展，以提供新的研究方向。本研究選擇2013年1-12月在本院產(chǎn)科產(chǎn)檢的孕婦100例，檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白4在妊娠期糖尿病患者和正常孕婦的不同孕周的血清及新生兒臍血中的含量變化，了解RBP4與GDM的關(guān)系，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1-12月在本院產(chǎn)科產(chǎn)檢的妊娠期糖尿病孕婦50例作為試驗(yàn)組，正常孕婦50例作為對(duì)照組。所選孕婦均無(wú)妊娠期高血壓、冠心病、肝腎功能損害、感染等合并癥，并且年齡、體質(zhì)指數(shù)、采血孕周等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較（x-±s）

1.2 妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照IADPSG2010診斷方法及標(biāo)準(zhǔn)，在妊娠24~28周首先檢查FPG，F(xiàn)PG≥5.1 mmol/L，可診斷。4.4 mmol/L≤FPG<5.1 mmol/L，則行OGTT：空腹測(cè)血糖1次，然后5 min內(nèi)口服75 g糖，服糖后l、2 h分別測(cè)血糖，血糖判定標(biāo)準(zhǔn)為5.1、10.0、8.5 mmol/L，如血糖有1項(xiàng)達(dá)到或超過(guò)正常值可診斷為GDM，3項(xiàng)均正常為NGT。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 于孕31~33周（Ⅰ）、37~41周（Ⅱ）采取孕婦空腹肘靜脈血，產(chǎn)后即刻采取足月新生兒臍血（Ⅲ），孕婦采血前3 天正常飲食與作息，每天碳水化合物攝入量在150 g以上。采血前晚要求禁食12 h，晨起8點(diǎn)抽取空腹靜脈血，靜置2 h使充分凝固，以1000 r/min離心10 min，取上清液（血清）分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。但?yīng)避免反復(fù)凍融，-80 ℃不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，標(biāo)本溶血會(huì)影響結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不應(yīng)進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。所有血樣統(tǒng)一編號(hào)保存，各項(xiàng)指標(biāo)均統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定血清RBP4水平，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)DR公司，批內(nèi)差異<57%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均平衡至室溫，嚴(yán)格按照說(shuō)明書將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓變?nèi)加樣品稀釋液100 μL，其他孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，注意將樣品加于酶標(biāo)板底部，不觸及孔壁，輕輕搖動(dòng)混勻，避免氣泡，用酶標(biāo)板覆膜，37 ℃溫育2 h。棄去液體，甩干，每孔加臨用前配制的檢測(cè)溶液A工作液100 μL（生物素化抗體溶液），酶標(biāo)板覆膜，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1~2 min，甩干。每孔加臨用前配制的檢測(cè)溶液B工作液100 μL（HRP酶結(jié)合物溶液），酶標(biāo)板覆膜，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，酶標(biāo)板覆膜，37 ℃避光顯色，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3~4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3~4孔梯度不明顯時(shí)終止。以與底物液的加入順序相同的順序加終止液50 μL終止反應(yīng)，藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。提前設(shè)定好酶標(biāo)儀（美國(guó)BIORAD iMark型全自動(dòng)酶標(biāo)儀），在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量，直接讀出檢測(cè)樣本的濃度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各指標(biāo)均服從近似正態(tài)分布，計(jì)量資料以（±s）表示，方差齊比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊比較采用t’檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，RBP4與其他臨床指標(biāo)指標(biāo)間的關(guān)系判定分別進(jìn)行直線相關(guān)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清RBP4水平比較 兩組血清RBP4比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1680.85，P<0.001）；不同采血時(shí)段血清RBP4比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7285.51，P<0.001）；兩組血清RBP4的差值在不同采血時(shí)段逐漸增加，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1381.70，P<0.001），見(jiàn)表 2~3。

表2 兩組血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平比較（x-±s）μg/mL

表3 重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表

2.2 不同采血時(shí)段兩兩比較 隨著孕周的增加RBP4增加，不同時(shí)間段兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；試驗(yàn)組RBP4增加的幅度大于對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)表4。

表4 不同采血時(shí)段兩兩比較結(jié)果表

2.3 試驗(yàn)組血清RBP4水平與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 血清RBP4水平與FBG、FINS、HOMA-IR均呈明顯正相關(guān)（P<0.001），見(jiàn)表5。

表5 試驗(yàn)組血清RBP4水平與其他臨床指標(biāo)的直線相關(guān)性分析

3 討論

GDM是指妊娠期發(fā)現(xiàn)或首次發(fā)生的不同程度的糖代謝異常，GDM與多種母兒并發(fā)癥密切相關(guān)，GDM對(duì)母嬰的危害極大，易導(dǎo)致血管病變，而發(fā)生胎兒宮內(nèi)窘迫、巨大兒、子癇、胎盤早剝、早產(chǎn)等并發(fā)癥。而GDM早期診斷與治療尤其重要，人們對(duì)它研究了多年，但迄今為止GDM的發(fā)病機(jī)制尚不清，有學(xué)者提出，GDM可能是多種因素起作用而引起的一種疾病，研究脂肪因子，可進(jìn)一步探討GDM的發(fā)病機(jī)制，視黃醇結(jié)合蛋白4是2005年首先由美國(guó)學(xué)者Yang等[1]發(fā)現(xiàn)的由肝臟、脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子（adipokine），RBP4位于染色體10q23-q24，由RBP4基因編碼，主要功能是進(jìn)行維生素A的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝。RBP4屬于血漿視黃醇結(jié)合蛋白，RBP4與肥胖、糖尿病、肝病、心腦血管病等的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[3-5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)GDM婦女RBP4和血糖等指標(biāo)進(jìn)行了研究，已有研究證實(shí)，RBP4與胰島素抵抗關(guān)系密切[2]。Chan等[6]研究已發(fā)現(xiàn)，RBP4水平在妊娠期糖尿病孕婦血清中高于正常，任利容等[7]也認(rèn)為GDM孕婦血清RBP4水平明顯升高，RBP4可能參與了GDM孕婦糖代謝紊亂，劉靜婧等[8]研究發(fā)現(xiàn)RBP4可能在T2DM發(fā)生發(fā)展中起作用。本研究顯示隨著妊娠的進(jìn)展，血清RPB4水平呈上升趨勢(shì)，妊娠期糖尿病患者血清RPB4水平各時(shí)期均高于正常妊娠組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），與上述研究結(jié)果一致。但也有學(xué)者得出相反結(jié)論，Inoue等[9]的研究發(fā)現(xiàn)RBP4水平在早孕、中孕、晚孕時(shí)無(wú)明顯差異；Krzyzanowska等[10]的研究結(jié)果表明孕29周時(shí)，RBP4水平在GDM患者血清中明顯低于健康孕婦，而血清RBP4和視黃醇的比值卻顯著高于健康孕婦，并且血清RBP4水平與孕婦的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)呈正相關(guān)；Graham等[11]研究發(fā)現(xiàn)血清RBP4水平與胰島素抵抗存在顯著的正相關(guān)性，在GDM復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中，RBP4可能參與了孕婦血糖的調(diào)節(jié)，與GDM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。測(cè)量RBP4濃度會(huì)有助于預(yù)測(cè)婦女發(fā)展為妊娠糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[12]。但其具體的作用有待于進(jìn)一步的研究，結(jié)合GDM其他脂肪細(xì)胞因子的改變，對(duì)揭示脂肪因子與GDM的關(guān)系有一定幫助。王馳等[13]認(rèn)為RBP4推動(dòng)了對(duì)妊娠糖尿病、胰島素抵抗的研究，并已成為現(xiàn)今最受人關(guān)注的脂肪因子之一。張博等[14]認(rèn)為作為一種脂肪細(xì)胞因子，RBP4與胰島素抵抗之間的密切關(guān)系是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，明確其具體機(jī)制，將為糖脂代謝等相關(guān)問(wèn)題展開(kāi)新的思路，孫蕾芳等[15]研究顯示妊娠期糖尿病孕婦皮下脂肪組織RBP4水平高表達(dá)及血清RBP4高水平，可能是妊娠期糖尿病孕婦發(fā)生胰島素抵抗的機(jī)制之一，這些將對(duì)GDM發(fā)病機(jī)制的明確、GDM治療及后期隨訪與代謝綜合征的防治具有重要指導(dǎo)意義。

綜上所述，RBP4是體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要起著結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇的作用，本研究顯示，RBP4水平在妊娠期孕婦血清中顯著高于對(duì)照組，隨著妊娠的進(jìn)展RBP4逐漸升高，新生兒臍血中含量最高，血清RBP4水平，可能對(duì)妊娠期糖尿病的篩查、預(yù)測(cè)及評(píng)估預(yù)后有一定意義，同時(shí)為GDM的診斷與治療提供新的理論依據(jù)。

[1] Yang Q，Graham T E，Mody N，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes[J].Nature，2005，436（7049）：356-362.

[2] Wu H，Jia W，Bao Y，et al.Serum retinol binding protein 4 and nonaleoholie fatty 1iver disease in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Res Clin Pract，2008，79（2）：185-190.

[3] Yang Q，Graham T E，Mody N，et al.Serum retinol binding protein 694 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes[J].Nature，2005，436（7049）：356-362.

[4] Bobbert T，Raila J，Schwarz F，et al.Relation between retinol，retinol-binding protein 4，transthyretin and carotid intima media thickness[J].Atherosclerosis，2010，213（2）：549-551.

[5] Sasaki M，Otani T，Kawakami M，et al.Elevation of plasma retinolbinding protein 4 and reduction of plasma adiponectin in subjects with cerebral infarction[J].Metabolism，2010，59（4）：527-532.

[6] Chan T F，Chen H S，Chen Y C，et al.Increased serum retinolbinding protein 4 concentrations in women with gestational diabetes mellitus[J].Reprod Sci，2007，14（2）：169-174.

[7]任利容，于燕，黃小紅，等.妊娠期糖尿病孕婦血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平變化及臨床意義[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2011，5（4）：400-403.

[8]劉靜婧，任偉，李素芳，等.糖尿病患者和糖耐量異常個(gè)體血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平及影響因素的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2010，35（10）：1494-1496.

[9] Inoue S，Takamoto N，Akahori Y，et al.Elevated level of serum retinol-binding protein 4 in pregnancy-induced hypertension[J].Jobstet Gynaecol Res，2009，35（2）：293-230.

[10] Krzyzanowska K，Zemany L，Krugluger W， et al.Serum concentrations of retinol-binding protein 4 in women with and without gestational diabetes[J].Diabetologia，2008，51（7）：1115-1122.

[11] Graham T E，Yang Q，Bluher M，et al.Retinol-binding protein 4 and insulin resistance in lean，obese，and diabetic subjects[J].N Engl J Med，2006，354（24）：2552-2563.

[12] Klein K，Bancher-Todesca D，Leipold H，et al.Retinol-binding protein 4 in patients with gestational diabetes mellitus[J].J Womens Health（Larchmt），2010，19（3）：517-521.

[13]王馳，李強(qiáng).視黃醇結(jié)合蛋白4與妊娠糖尿病相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2012，25（8）：868-870.

[14]張博，張黎軍.視黃醇結(jié)合蛋白4與代謝綜合征關(guān)系的研究進(jìn)展[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，32（2）：277-279.

[15]孫蕾芳，陳維萍，李靜，等.妊娠期糖尿病孕婦血清及皮下脂肪組織中視黃醇結(jié)合蛋白4表達(dá)與胰島素抵抗的關(guān)系[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44（12）：915-919.