細(xì)菌信號(hào)小分子耐藥機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展

易勝杰，謝靖，邱少富，宋宏彬

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071；2.中南大學(xué) 湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013

使用抗生素對(duì)抗感染性疾病是醫(yī)學(xué)和人類(lèi)健康歷史上巨大的進(jìn)步。自從青霉素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究人員基于對(duì)細(xì)菌關(guān)鍵蛋白的化學(xué)抑制研發(fā)了多種抗生素，目前已經(jīng)在抗菌史上取得了十分偉大的成就。然而，這些年多重耐藥菌的發(fā)生率不斷提高，世界衛(wèi)生組織更是發(fā)表聲明稱(chēng)，細(xì)菌廣泛的耐藥已經(jīng)明顯成為威脅人類(lèi)生命與健康的全球性問(wèn)題[1]。人類(lèi)的抗菌過(guò)程就是細(xì)菌與抗生素相互抵抗的過(guò)程，由于抗生素濫用等原因?qū)е录?xì)菌的耐藥性不斷提高，但是近幾十年來(lái)卻只有2種新的抗生素被成功運(yùn)用于臨床治療，這種不平衡將帶來(lái)嚴(yán)重的安全隱患[2]。新型抗生素的匱乏很大程度上是因?yàn)槲覀冴P(guān)注的藥物靶標(biāo)比較單一，以及對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制的理解還不夠深入[3]。

目前被廣泛研究的細(xì)菌耐藥機(jī)制主要包括：抗生素滅活酶、改變抗生素靶位結(jié)構(gòu)、降低外膜通透性、加強(qiáng)主動(dòng)外排系統(tǒng)、形成生物膜等[4-8]。但是最近幾年，一種有別于傳統(tǒng)理念的耐藥機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，并被證明廣泛存在于細(xì)菌中，涌現(xiàn)了許多優(yōu)秀的相關(guān)研究和評(píng)論[9-14]。這些研究聚焦于一些細(xì)菌通過(guò)代謝產(chǎn)生的信號(hào)小分子，這些信號(hào)小分子能夠輕松地跨膜傳遞，它們通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)等機(jī)制使細(xì)菌獲得廣譜的耐藥性，甚至極少部分的細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)小分子就能夠?qū)е抡麄€(gè)菌群耐藥。這一理論的提出，不僅使得原有的細(xì)菌耐藥機(jī)制得到很好的補(bǔ)充和拓展，也為新型抗生素的研制提供了潛在性的靶標(biāo)和思路。為了更好地使研究者了解生物小分子導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的機(jī)制，探索抗生素新的潛在靶標(biāo)，我們通過(guò)細(xì)菌代謝產(chǎn)生的3種信號(hào)小分子——一氧化氮（NO）、硫化氫（H2S）和吲哚，探討信號(hào)分子使細(xì)菌獲得耐藥性的相關(guān)機(jī)制。

1 NO使細(xì)菌獲得廣譜的耐藥性

真核生物中的巨噬細(xì)胞或其他一些免疫細(xì)胞能通過(guò)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthases，iNOS）催化產(chǎn)生NO，這些NO能夠通過(guò)硝化應(yīng)激和氧化應(yīng)激作用控制胞內(nèi)細(xì)菌的感染[15]。但是，“聰明”的細(xì)菌通過(guò)進(jìn)化也能產(chǎn)生一種細(xì)菌一氧化氮合酶（bacterial nitric oxide synthases，bNOS）。bNOS沒(méi)有還原酶區(qū)域，生物信息學(xué)分析顯示許多細(xì)菌中都能找到和bNOS同源的蛋白，它們?cè)谶M(jìn)化上有密切聯(lián)系，并且對(duì)細(xì)菌有著重要的生命學(xué)意義[16]。Gusarov等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌內(nèi)源性的NO能夠讓細(xì)菌獲得廣譜的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，吖啶黃和NO混合處理過(guò)后對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的殺傷能力顯著降低，構(gòu)建的bNOS大腸桿菌表達(dá)體系也能顯著降低吖啶黃的濃度，其主要原因是NO能直接與吖啶黃反應(yīng)，使吖啶黃亞硝基化失活。不僅如此，NO還能保護(hù)細(xì)菌抵御吖啶黃引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。這表明NO能夠直接改造某些抗生素，并且抵御抗生素引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，從而幫助細(xì)菌獲得耐藥性。那么，NO如何抵御抗生素引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷？研究人員發(fā)現(xiàn)，在綠膿菌素的壓力下（NO不能直接與其發(fā)生反應(yīng)），bNOS能夠誘導(dǎo)過(guò)氧化物歧化酶（cata?lase and superoxide dismutase，SOD）的表達(dá)，從而抑制胞內(nèi)氧化應(yīng)激，并表現(xiàn)出對(duì)綠膿菌素的耐藥性，但是bNOS缺失株卻不能誘導(dǎo)SOD表達(dá)，也沒(méi)有表現(xiàn)出耐藥性。不僅如此，加入一定濃度的頭孢呋辛后，野生株與bNOS缺失株在生長(zhǎng)曲線和生存曲線上都表現(xiàn)出明顯差異，而加入活性氧分子（reactive oxy?gen species，ROS）抑制劑或外源的NO都能顯著提高缺失株的存活率。重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，NO可使細(xì)菌對(duì)我們常用的許多抗生素耐受[12]。而另一個(gè)重要機(jī)制在Shatalin等的研究中闡明，炭疽桿菌能通過(guò)bNOS產(chǎn)生的NO激活細(xì)菌的過(guò)氧化氫酶，并抑制對(duì)自身有損傷性的芬頓反應(yīng)，最終達(dá)到抵御胞內(nèi)氧化應(yīng)激[17]。Gusarov等在枯草芽孢桿菌中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似機(jī)制，細(xì)菌依靠bNOS產(chǎn)生的NO來(lái)抵御宿主免疫系統(tǒng)帶來(lái)的氧化應(yīng)激損傷[18]。bNOS能夠抵御來(lái)自宿主的氧化應(yīng)激損傷，這在很大程度上也和抵抗抗生素相似，因?yàn)檠趸瘧?yīng)激很可能是許多抗生素殺菌過(guò)程中的關(guān)鍵因素[19]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌去除內(nèi)源性NO后，就馬上變得對(duì)氧化應(yīng)激和萬(wàn)古霉素等抗生素敏感[20]。這些研究都表明，NO能通過(guò)多種機(jī)制幫助細(xì)菌獲得廣譜的耐藥性。

2 H2S是細(xì)菌的一種普遍耐藥機(jī)制

產(chǎn)H2S的機(jī)制普遍存在于真核和原核生物中。盡管研究結(jié)果有一些差異，但毋庸置疑的是H2S調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包括炎癥、上皮細(xì)胞分泌、傷害感受等[21-23]。在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)3種可催化產(chǎn)生H2S的酶，即胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST）。對(duì)細(xì)菌的基因組分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分細(xì)菌都至少能表達(dá)3種酶中的一種[13]。除此之外，一些特殊的細(xì)菌能基于不同的底物和途徑產(chǎn)生H2S。如沙門(mén)菌就能通過(guò)phs和asr操縱子分別以硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽為底物產(chǎn)生H2S[24-25]。在人體內(nèi)，尤其是腸道環(huán)境中，宿主和細(xì)菌都能產(chǎn)生大量H2S，并且相互影響、相互作用[26-27]。對(duì)于細(xì)菌本身，H2S也有著重要的生物學(xué)意義。Shatalin等通過(guò)對(duì)4種不同細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)H2S基因的缺失株與野生株相比對(duì)慶大霉素、卡那霉素、氯霉素更加敏感，在高濃度抗生素壓力下缺失株存活率顯著降低，但加入外源H2S后，存活率與野生株沒(méi)有顯著差異，這與bNOS對(duì)細(xì)菌的影響十分相似。對(duì)大腸桿菌的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，慶大霉素能夠顯著抑制3MST缺失株的生長(zhǎng)，但是加入ROS抑制劑后生長(zhǎng)曲線與野生株沒(méi)有差異。另外，3MST缺失、過(guò)表達(dá)和野生株能不同程度地誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶和SOD的表達(dá)，3MST的活性與過(guò)氧化氫酶和SOD表達(dá)量是正相關(guān)的。這表明H2S能通過(guò)激活過(guò)氧化氫酶和SOD抵御抗生素引起的氧化應(yīng)激損傷，從而使細(xì)菌獲得耐藥性。這一機(jī)制能使細(xì)菌獲得長(zhǎng)久的耐藥性，但是在抗生素發(fā)揮作用的初期，H2S主要是通過(guò)與游離的Fe2+直接發(fā)生反應(yīng)，從而抑制DNA損傷性的芬頓反應(yīng)。多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，H2S同樣能使細(xì)菌對(duì)頭孢類(lèi)、喹諾酮類(lèi)等常見(jiàn)抗生素的耐藥性增加[13]。

3 少數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生的吲哚就能導(dǎo)致菌群耐藥

吲哚是一種細(xì)胞間的信號(hào)分子，多種革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌都能產(chǎn)生[28]。產(chǎn)生吲哚最重要的一種酶是色氨酸酶（tryptophanase，TnaA），它能可逆地將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚、丙酮酸和氨[29-30]。許多研究認(rèn)為吲哚在大腸桿菌中是一種壓力信號(hào)分子，在抗生素等壓力狀態(tài)下，吲哚能通過(guò)激活藥物外排泵相關(guān)基因從而對(duì)抗生素耐受[28,31-32]。Lee等基于此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，他們不斷提高大腸桿菌培養(yǎng)基中諾氟沙星的濃度，發(fā)現(xiàn)整個(gè)菌群都能耐藥，但絕大多數(shù)大腸桿菌個(gè)體的耐藥性都沒(méi)有整體的耐藥性高。通過(guò)全基因組測(cè)序分析，他們發(fā)現(xiàn)某些大腸桿菌在關(guān)鍵耐藥基因上發(fā)生了突變，如gyrB22，而這些突變讓這些大腸桿菌獲得對(duì)諾氟沙星的耐藥性。這些耐藥菌通過(guò)產(chǎn)生吲哚可以保護(hù)其他對(duì)諾氟沙星敏感的菌株，但那些處于抗生素壓力下的非耐藥菌卻不能產(chǎn)生吲哚。為了進(jìn)一步探究吲哚導(dǎo)致大腸桿菌耐藥的機(jī)制，研究者通過(guò)對(duì)野生株和TnaA缺失株在抗生素壓力下的轉(zhuǎn)錄組對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)吲哚能夠上調(diào)一些藥物外排泵相關(guān)基因，如mdtE。更有意思的是，分析結(jié)果顯示一個(gè)小RNA oxyS的表達(dá)量被下調(diào)了，這個(gè)小RNA是細(xì)菌內(nèi)氧化應(yīng)激的感受器。這些結(jié)果表明，吲哚至少可能通過(guò)激活藥物外排基因以及降低氧化應(yīng)激損傷使大腸桿菌對(duì)抗生素耐受[14]。吲哚誘導(dǎo)持留菌的形成或許也是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的一種機(jī)制。持留菌的顯著特點(diǎn)是，在抗生素等逆境條件下處于非分裂增長(zhǎng)的休眠狀態(tài)，降低代謝活動(dòng)以維持自身的生存；而當(dāng)抗生素或逆境條件消失時(shí)，持留菌又可重新恢復(fù)生長(zhǎng)，并進(jìn)行增殖再生。Vega等發(fā)現(xiàn)，在氧氟沙星的壓力下，大腸桿菌野生株的存活率明顯高于TnaA缺失株，但在無(wú)色氨酸的培養(yǎng)基中，兩者之間沒(méi)有差異。同時(shí)研究人員還用微流控技術(shù)監(jiān)測(cè)到在卡那霉素處理后，吲哚能明顯促進(jìn)持留菌形成，這表明吲哚信號(hào)在誘導(dǎo)大腸桿菌形成持留菌對(duì)抗生素耐受的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。吲哚信號(hào)能通過(guò)激活大腸桿菌的氧化應(yīng)激和噬菌體侵襲壓力反應(yīng)從而對(duì)抗生素產(chǎn)生耐受，最終導(dǎo)致了持留菌的形成[33]。吲哚的產(chǎn)生受多種因素如碳源、氮源、pH值、環(huán)境壓力等影響[34]，可能是多種因素使細(xì)菌“感受到危機(jī)”從而產(chǎn)生吲哚，產(chǎn)生的吲哚再逐步引導(dǎo)細(xì)菌轉(zhuǎn)變成持留菌。

4 信號(hào)分子之間的協(xié)作

3種信號(hào)分子有一個(gè)共同點(diǎn)，就是它們能使細(xì)菌對(duì)抗多種抗生素和氧化應(yīng)激損傷。胞內(nèi)氧化應(yīng)激的特征是代謝或呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的ROS與抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破。抗生素發(fā)揮抗菌作用時(shí)，氧化應(yīng)激一直被認(rèn)為是一個(gè)重要的因素[19]。盡管最近一些研究對(duì)這一理論提出了質(zhì)疑[35-36]，但本文所涉及的3種信號(hào)分子在抵抗氧化應(yīng)激和抗生素這一點(diǎn)上表現(xiàn)出很強(qiáng)的一致性[12-13，33]。這也暗示著它們?cè)诖x通路和作用機(jī)制上一定有著密切的聯(lián)系。NO、H2S和吲哚產(chǎn)生的底物是3種不同的氨基酸，分別為精氨酸、半胱氨酸和色氨酸。胞內(nèi)高濃度的半胱氨酸會(huì)促進(jìn)有DNA損傷性的芬頓反應(yīng)[37]，而NO能通過(guò)影響半胱氨酸來(lái)抑制芬頓反應(yīng)[18]。產(chǎn)生吲哚的色氨酸酶TnaA與半胱氨酸在調(diào)控和代謝上也有密切聯(lián)系。這表明3種信號(hào)分子在代謝的上游就表現(xiàn)出了密切的聯(lián)系。Shatalin等還探究了NO和H2S對(duì)抗氧化應(yīng)激和抗生素過(guò)程中的協(xié)同作用，他們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是NO還是H2S缺失后，另一種信號(hào)分子的表達(dá)量在抗生素的壓力下會(huì)比野生株更高。這表明，NO和H2S對(duì)抗氧化應(yīng)激和抗生素時(shí)具有協(xié)同作用，并在一定程度上能夠相互補(bǔ)償[13]。而在吲哚的作用下，大腸桿菌的NO反應(yīng)系統(tǒng)也同樣被激活，從而協(xié)同抵抗氧化應(yīng)激和抗生素[14]。盡管有些細(xì)菌并不能產(chǎn)生3種信號(hào)分子，但它們有可能進(jìn)化出類(lèi)似的補(bǔ)償機(jī)制。如沙門(mén)菌不能產(chǎn)生NO，但它能利用宿主產(chǎn)生的NO降低自身呼吸強(qiáng)度，從而減少氨基糖苷類(lèi)抗生素的攝入量[38]。更有意思的是，沙門(mén)菌甚至能夠攔截大腸桿菌的吲哚信號(hào)，通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)或激活藥物外排基因從而達(dá)到對(duì)抗生素耐受[39-40]。以上研究表明，3種信號(hào)分子很可能在對(duì)抗氧化應(yīng)激和抗生素時(shí)具有某種共同的作用機(jī)制，在不同的情況下發(fā)揮作用，卻又能相互協(xié)作相互影響（圖1）。

5 信號(hào)小分子導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的特征

一般研究耐藥菌都會(huì)集中在許多與某種特定抗生素相關(guān)的耐藥基因，這種通過(guò)基因突變或基因水平轉(zhuǎn)移對(duì)某種藥物產(chǎn)生耐藥性的情況會(huì)造成整個(gè)群體都變成耐藥株。因?yàn)榭股氐暮Y選會(huì)淘汰不耐藥的菌株，含有耐藥基因的菌株就被選擇出來(lái)。但是信號(hào)分子導(dǎo)致的群體耐藥則是完全不同的情況，極少量菌株會(huì)產(chǎn)生一些信號(hào)分子并且分泌到胞外，它們將通過(guò)激活藥物外排泵或抗氧化酶等多種機(jī)制使得整個(gè)菌群產(chǎn)生耐藥。因此，菌群的多樣性被保存下來(lái)，并且絕大多數(shù)菌株并不具有太強(qiáng)的耐藥性。這種情況已在上述研究中被證實(shí)，耐藥菌株產(chǎn)生的吲哚能夠保護(hù)菌群中不耐藥的菌株[14]，而大腸桿菌野生株產(chǎn)生的H2S也能保護(hù)3MST缺失的突變株[13]。NO、H2S和吲哚這些信號(hào)小分子能夠很方便地跨膜運(yùn)輸，在菌群中發(fā)揮功能。少量個(gè)體的利他行為就能以最小的代價(jià)使群體對(duì)外界抗生素產(chǎn)生耐受。如果外界抗生素壓力只是暫時(shí)的，那么這樣的策略就能最大限度地保留種群的多樣性。這種利他行為是一種類(lèi)似親緣選擇的現(xiàn)象，既保證了菌群的生存，又保留了探索更有利突變的空間，符合微生物的社會(huì)進(jìn)化理論[41]。

圖1 3種信號(hào)分子的耐藥機(jī)制和協(xié)同作用

6 結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌信號(hào)小分子幫助細(xì)菌抵御抗生素，是對(duì)目前細(xì)菌耐藥理論和模型的一個(gè)非常重要的補(bǔ)充，有助于我們更全面地理解細(xì)菌耐藥的機(jī)制。更重要的是，這些新發(fā)現(xiàn)能幫助我們擴(kuò)大抗生素藥物篩選的范圍，通過(guò)抑制這些生物小分子發(fā)揮作用研制新型抗生素或抗生素的佐劑。目前已發(fā)現(xiàn)添加bNOS的抑制物能使細(xì)菌變得對(duì)抗生素更加敏感[42-43]。但是，目前對(duì)這些信號(hào)小分子產(chǎn)生耐藥的具體分子機(jī)制還不是非常清楚，尤其是多種小分子是否有非常明確的共同通路或耐藥機(jī)制。還有許多問(wèn)題亟待廣大學(xué)者去攻破，但這項(xiàng)研究對(duì)抗生素的研發(fā)、對(duì)人類(lèi)的生命健康安全具有重大意義。

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