噬菌體肽庫篩選抗人B7-H4中和抗體的模擬抗原表位及其免疫原性鑒定

李曉菊 ，高源 ，張旺倩 ，張存

1.腫瘤生物學(xué)國家重點實驗室；

2.第四軍醫(yī)大學(xué) a.藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；b.學(xué)員一旅四營十四連；陜西 西安 710032

B7-H4，也被稱為B7-S1，是2003年發(fā)現(xiàn)的共刺激分子B7超家族的一員[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀態(tài)下，B7-H4的mRNA雖然廣泛分布于人體各個組織，但是其蛋白質(zhì)的表達(dá)受嚴(yán)格調(diào)控，僅見于刺激后的人T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞；并且，和經(jīng)典的B7-1/B7-2分子不同，B7-H4分子通過抑制細(xì)胞周期、增殖、細(xì)胞因子分泌，從而抑制T細(xì)胞反應(yīng)[2]。在B7-H4基因敲除小鼠中，并沒有出現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)和過高的CTL活性，但Th1細(xì)胞反應(yīng)明顯增高，這提示B7-H4屬于免疫系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)節(jié)分子[3]。在病理狀態(tài)下，很多腫瘤細(xì)胞表面及腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞高表達(dá)B7-H4，并且能夠降低腫瘤特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸，還與腫瘤病人不良預(yù)后直接相關(guān)，這提示B7-H4可以作為腫瘤免疫治療的靶點[4-6]。有實驗室研究發(fā)現(xiàn)，用抗B7-H4單鏈抗體可變區(qū)（scFv）治療人源化小鼠的卵巢癌，能夠顯著抑制腫瘤生長；在體外也能夠通過阻斷B7-H4+的抗原呈遞細(xì)胞（APC）的抑制作用，恢復(fù)腫瘤特異性T細(xì)胞的活性[7]。

1985年，Smith等科學(xué)家利用基因工程技術(shù)將外源蛋白表達(dá)在絲狀噬菌體衣殼蛋白表面，建立了噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)[8]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的噬菌體隨機短肽文庫，因其庫容量大、操作簡便，廣泛應(yīng)用于篩選與某一蛋白，比如配體、抗體、酶等特異性結(jié)合的小分子肽，從而發(fā)現(xiàn)新的導(dǎo)向分子或治療靶位。在本研究中，我們以抗人B7-H4（hB7-H4）中和抗體為靶分子，利用噬菌體隨機呈現(xiàn)12肽庫篩選可與之結(jié)合的12肽，從而模擬hB7-H4抗原表位；并將篩選得到的12肽與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）或破傷風(fēng)毒素（TT）偶聯(lián)免疫小鼠來驗證其免疫原性，為進一步開發(fā)真正應(yīng)用于臨床的抗hB7-H4的短肽疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，21～25 g）購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；B7-H4+小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0由本室保存；宿主大腸桿菌ER2738、噬菌體隨機線性 12 肽 庫（pH.D.-12 phage display peptide li?brary）、測序引物-96primer均購自New England Bi?olabs公司；抗hB7-H4單克隆中和抗體、hB7-H4/Fc分子均購自R&D公司；人IgG1 Fc段購自Roche公司；HRP-抗M13單抗購自Amersham Biosciences公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自武漢博士德公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 噬菌體12肽庫的篩選

體外生物淘洗共進行3輪。第一輪篩選與擴增：于96孔酶聯(lián)板包被抗hB7-H4單克隆抗體（100 μg/mL，200 μL/孔），4℃過夜；加入噬菌體12肽庫100 μL（約含噬菌體2×1011pfu/100 μL）；洗掉未結(jié)合的噬菌體；加入100 μL洗脫液（10 g/L BSA，0.2 mol/L甘氨酸-鹽酸，pH2.2）洗脫，室溫輕搖8 min，迅速吸出液體并加入15 μL中和液（1 mol/L Tris-HCl，pH9.1）中和；取 2 μL洗脫下來的噬菌體測滴度，余下的液體感染宿主菌ER2738，擴增，純化，進行下一輪篩選。第2輪和第3輪篩選保持抗體包被濃度不變，加入上一輪擴增純化的噬菌體（2×1011pfu/100 μL），洗滌液為0.5%TBST。3次篩選后隨機挑選50個分隔良好的陽性克隆于大腸桿菌ER2738中擴增，純化，用于噬菌體ELISA.

1.3 特異性ELISA鑒定

用抗hB7-H4單克隆抗體或人抗體Fc段（陰性對照）包被96孔酶聯(lián)板（每孔100 ng/100 μL），4℃孵育過夜；分別加入篩選純化的噬菌體克隆及無關(guān)噬菌體克隆（對照克?。?×109pfu/孔），室溫孵育2 h；之后加入HRP標(biāo)記的小鼠抗M13噬菌體抗體（1∶5000）100 μL，室溫孵育1 h；ABTS顯色，測定D405nm值。每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。陽性克隆結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為D405nm值高于陰性對照2倍以上，且陰性對照值低于0.1。

1.4 序列測定

通過噬菌體ELISA的鑒定，挑取結(jié)合活性高的20個噬菌體克隆，經(jīng)過PEG-8000/NaCl純化后，抽提ssDNA，交由上海生工公司進行序列測定，測序引物為噬菌體肽庫自帶的-96primer。

1.5 競爭性細(xì)胞ELISA

ELISA板中加入SP2/0細(xì)胞（4.5×105/孔），1200 r/min離心12 min；加入封閉液，4℃封閉2 h；分別加入不同稀釋度（1×1012或1×1011pfu/孔）的噬菌體克隆，4℃孵育2 h，TBST洗6次；加入抗hB7-H4抗體（0.1 μg/mL，100 μL/孔），BST洗 6次；加入HRP標(biāo)記的二抗，顯色。陰性對照為無關(guān)噬菌體。

1.6 化學(xué)合成及偶聯(lián)

化學(xué)合成測序得到的出現(xiàn)頻次最高的3組多肽序列（分別命名為1號肽、2號肽和3號肽）。用戊二醛法將1號肽的N端分別偶聯(lián)免疫原載體蛋白KLH或TT。偶聯(lián)過程如下：將多肽和載體蛋白在PBS中以一定摩爾比例（多肽∶KLH/TT為40∶1）混合溶解，緩慢加入2%戊二醛溶液促進偶聯(lián)，用分子量排阻色譜（Sephadex G-25，GE公司）將未結(jié)合與結(jié)合的多肽分離。

1.7 斑點雜交

分別將1、2、3號肽（1 μg）緩慢滴在硝化纖維膜上，加入封閉液（5 mg/L BSA），4℃封閉2 h；將膜置于抗hB7-H4抗體或?qū)φ湛贵w溶液（1 μg/mL）中室溫孵育2 h，TBST洗3次；加入HRP標(biāo)記的二抗，顯色。

1.8 動物免疫

將健康雌性BALB/c小鼠隨機分為5組（A組：1號肽-KLH；B組：1號肽-TT；C組：KLH組；D組：TT組；E組：生理鹽水組），6只/組，將各組多肽與弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑（CFA/IFA）按體積比1∶1混合，背部皮下免疫，每只小鼠40 μg多肽/200 μL，分別于0、14、28 d免疫；于第42 d不加佐劑，腹腔注射，加強免疫一次；第4次免疫10 d后眼眶取血，收集抗血清鑒定。

1.9 ELISA測定血清抗體滴度

具體步驟參照參考文獻[9]。

1.10 補體依賴的殺傷活性（CDC）檢測

首先準(zhǔn)備補體（健康豚鼠取血，4℃過夜，離心，分離血清，分裝凍于-80℃?zhèn)溆茫?；將SP2/0細(xì)胞（每孔5×104/50 μL）接種于圓底的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入不同體積的抗血清（25 μL/孔）及抗hB7-H4抗體（0.1 μg/孔，陽性對照），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；分別加入補體血清（50 μL/孔），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育90 min；通過MTT檢測細(xì)胞殺傷效率。

2 結(jié)果

2.1 生物淘洗和克隆篩選

以抗hB7-H4單抗為靶標(biāo)分子對噬菌體線性12肽庫進行3輪體外生物淘洗。在3輪篩選中，抗hB7-H4單抗的起始包被濃度不變，每一輪噬菌體的回收率卻在升高（表1），說明特異性噬菌體被成功富集。收集第3輪洗脫下來的噬菌體，擴增，挑取50個克隆進行檢測，其中20個克隆與抗hB7-H4單抗呈高親和力，同時與陰性對照的人IgG1 Fc段不結(jié)合。 將20個陽性克隆進行DNA序列測定，得到6組12肽序列（表2），其中DQLKTMWEQPFW出現(xiàn)頻率最高，提示相應(yīng)的肽段可能與抗hB7-H4單抗的抗體決定簇具有高反應(yīng)性。

2.2 陽性噬菌體克隆的ELISA鑒定

將測序得到的6組噬菌體進行ELISA鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6組模擬表位肽序列均與抗hB7-H4單抗有很強的結(jié)合力，而與同型對照的人IgG1 Fc段及封閉蛋白BSA的結(jié)合力很弱；另外，抗hB7-H4單抗也基本不與對照12肽噬菌體結(jié)合（圖1）。

表1 從噬菌體線性12肽庫對抗hB7-H4單抗結(jié)合短肽的3輪親和篩選結(jié)果

表2 陽性克隆的序列分析

2.3 競爭性細(xì)胞ELISA分析

選取頻次出現(xiàn)最高的3組噬菌體肽（1號肽：DQLKTMWEQPFW；2號肽：QQTNKMWEAPFW；3號肽：RQYSHMWAEPFW）來檢測噬菌體模擬表位肽能否抑制抗hB7-H4單抗與hB7-H4陽性的SP2/0細(xì)胞之間的結(jié)合。結(jié)果顯示，只有1號肽能抑制抗hB7-H4單抗與SP2/0細(xì)胞之間的結(jié)合，且抑制能力隨著加入噬菌體滴度的增高而增強，具有濃度依賴性（圖2）。該結(jié)果提示1號多肽序列可能能夠特異性模擬hB7-H4抗原表位與抗hB7-H4單抗的結(jié)合。

2.4 點雜交分析

為了排除噬菌體本身的干擾，進一步檢測篩選出來的多肽能否特異性地與抗hB7-H4抗體結(jié)合，我們化學(xué)合成了1、2、3號肽序列，通過點雜交驗證多肽與抗hB7-H4抗體結(jié)合的特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有肽均不與人IgG1 Fc段結(jié)合（圖3B），但只有1號肽能夠特異性地結(jié)合抗hB7-H4抗體（圖3A）。綜合以上結(jié)果，說明只有1號肽能夠特異性地模擬hB7-H4抗原表位，與抗hB7-H4抗體結(jié)合。

2.5 多肽融合疫苗免疫原性的檢測

圖1 6組陽性噬菌體克隆與抗hB7-H4單抗的ELISA結(jié)果

圖2 陽性噬菌體克隆的競爭性細(xì)胞ELISA結(jié)果

圖3 合成多肽與抗hB7-H4抗體的點雜交結(jié)果

為了驗證篩選得到的1號肽的免疫原性，分別用1號肽-KLH和1號肽-TT免疫BALB/c小鼠，收集抗血清，用ELISA檢測抗體滴度。結(jié)果顯示，2組1號肽偶聯(lián)分子均誘導(dǎo)出高滴度的hB7-H4特異性抗體（＞1∶100 000）（圖4），說明1號肽具有良好的免疫原性。

2.6 CDC分析

為了驗證1號肽誘導(dǎo)的抗血清與抗hB7-H4單抗有相同的生物學(xué)作用，我們對抗血清進行了CDC檢測。結(jié)果顯示，2組1號肽偶聯(lián)分子均能夠通過CDC作用殺傷hB7-H4+的SP2/0細(xì)胞，并且具有濃度依賴性（圖5）。

圖4 ELISA檢測多肽融合疫苗的免疫原性

圖5 MTT檢測抗血清對SP2/0細(xì)胞的補體依賴的殺傷作用

3 討論

免疫治療一直是腫瘤治療的熱點。雖然免疫治療在實驗室及動物身上取得了不錯的效果，但臨床應(yīng)用不太理想，究其原因，是因為腫瘤存在免疫逃逸。最近，研究者們聚焦于腫瘤免疫的負(fù)調(diào)節(jié)因素，例如CD4+CD25+Treg、PD-L1/PD-1、CTLA-4、TGF-β，阻斷負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用，其中PD-1的單抗已被美國FDA批準(zhǔn)上市[10]。我們實驗室一直致力于這方面的研究，從主動免疫入手，也用基因工程方法開發(fā)了B7-H1、B7-H4自體融合蛋白疫苗，在實驗動物身上取得了不錯的抑瘤效果[9,11]。

相對于蛋白疫苗，多肽疫苗的生產(chǎn)工藝更簡單，直接化學(xué)合成即可獲得。但由于多肽分子小、半衰期短，所以多肽疫苗多與一些分子較大的異源載體蛋白如白喉類毒素（DT）、TT、KLH偶聯(lián)進行免疫，這些載體蛋白既可以增強疫苗的免疫原性，又可以延長疫苗在體內(nèi)的半衰期[12-14]。目前胃泌素多肽疫苗也已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療晚期胰腺癌[15]。在本研究中，我們嘗試把篩選出的hB7-H4模擬抗原表位12肽與KLH、TT偶聯(lián)，免疫小鼠后均誘導(dǎo)出高滴度抗體，證明該方法確實具有可行性。

噬菌體隨機多肽庫是篩選細(xì)胞或組織特異性導(dǎo)向多肽、蛋白分子相互作用的小分子多肽的有力工具。我們課題組在前期工作基礎(chǔ)上，通過噬菌體隨機12肽庫技術(shù)試圖篩選得到一些hB7-H4的候選模擬抗原表位，但實驗證明并不是篩選得到的所有陽性多肽都能夠模擬真正的hB7-H4抗原表位，所以要通過噬菌體ELISA、競爭ELISA、斑點雜交等體外實驗及體內(nèi)免疫實驗進一步驗證。在本研究中，我們最終篩選得到一個hB7-H4蛋白的模擬抗原表位12肽（DQLKTMWEQPFW），在后續(xù)工作中，我們將進一步通過生物信息學(xué)技術(shù)、晶體衍射技術(shù)等深入分析該12肽的結(jié)構(gòu)特點，為其能夠真正應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

[1] Sica G L,Choi I H,Zhu G,et al.B7-H4,a molecule of the B7 family,negatively regulates T cell immunity[J].Immu?nity,2003,18(6):849-861.

[2] Choi I H,Zhu G,Sica G L,et al.Genomic organization and expression analysis of B7-H4,an immune inhibitory molecule of the B7 family[J].J Immunol,2003,171(9):4650-4654.

[3] Suh W K,Wang S,Duncan G S,et al.Generation and char?acterization of B7-H4/B7S1/B7x-deficient mice[J].Mol Cell Bi?ol,2006,26(17):6403-6411.

[4] Kryczek I,Zou L,Rodriguez P,et al.B7-H4 expression iden?tifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma[J].J Exp Med,2006,203(4):871-881.

[5] Abadi Y M,Jeon H,Ohaegbulam K C,et al.Host b7x pro?motes pulmonary metastasis of breast cancer[J].J Immunol,2013,190(7):3806-3814.

[6] He C,Qiao H,Jiang H,et al.The inhibitory role of b7-h4 in antitumorimmunity:association with cancerprogression and survival[J].Clin Dev Immunol,2011,doi:10.1155/2011/695834.

[7] Dangaj D,Lanitis E,Zhao A,et al.Novel recombinant hu?man b7-h4 antibodies overcome tumoral immune escape to po?tentiate T-cell antitumor responses[J].Cancer Res,2013,73(15):4820-4829.

[8] Smith G P.Filamentous fusion phage:novel expression vec?tors that display cloned antigens on the virion surface[J].Sci?ence,1985,228(4705):1315-1317.

[9] Mu N,Liu N,Hao Q,et al.Inhibition of mouse SP2/0 myelo?ma cell growth by the B7-H4 protein vaccine[J].BMB Rep,2014,47(7):399-404.

[10]Brahmer J R,Tykodi S S,Chow L Q,et al.Safety and activi?ty of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer[J].N Engl J Med,2012,366(26):2455-2465.

[11]Zhang C,Wang W,Qin X,et al.B7-H1 protein vaccine in?duces protective and therapeutic antitumor responses in SP2/0 myeloma-bearing mice[J].Oncol Rep,2013,30(5):2442-2448.

[12]Iaria M L,Fiorentini S,Foca E,et al.Synthetic HIV-1 ma?trix protein p17-based AT20-KLH therapeutic immunization in HIV-1-infected patients receiving antiretroviral treatment:A phase I safety and immunogenicity study[J].Vaccine,2014,32(9):1072-1078.

[13]Yamaguchi Y,Yamaue H,Okusaka T,et al.Guidance for peptide vaccines for the treatment of cancer[J].Cancer Sci,2014,105(7):924-931.

[14]Knuf M,Pantazi-Chatzikonstantinou A,Pfletschinger U,et al.An investigational tetravalent meningococcal serogroups A,C,W-135 and Y-tetanus toxoid conjugate vaccine co-adminis?tered with Infanrix hexa is immunogenic,with an acceptable safety profile in 12-23-month-old children[J].Vaccine,2011,29(25):4264-4273.

[15]Gilliam A D,Watson S A.G17DT:an antigastrin immunogen for the treatment of gastrointestinal malignancy[J].Expert Opin Biol Ther,2007,7(3):397-404.