人白細(xì)胞介素7在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及活性鑒定

李金松，麻粉蓮，張騫，鄭麗舒

中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

白細(xì)胞介素（interleukins，IL）是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。白細(xì)胞介素7（IL-7）是由腸道上皮細(xì)胞，淋巴結(jié)的濾泡樹突狀細(xì)胞和網(wǎng)狀纖維細(xì)胞，脾、骨髓和胸腺等基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子[1-2]。IL-7通過CD127和CD132受體復(fù)合物激活Janus激酶（JAK）1/JAK3信號，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白5（STAT5）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）提高抗凋亡蛋白表達(dá)等，來提高T細(xì)胞分化發(fā)育、成熟的T細(xì)胞的存活和胸腺輸出新生的T細(xì)胞，因此對T細(xì)胞的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用[3-5]。不僅能夠促進(jìn)免疫系統(tǒng)恢復(fù)，還可以消除慢病毒或腫瘤引起的免疫耐受。αβ-T細(xì)胞對一些蛋白、病毒慢性感染或腫瘤等免疫反應(yīng)較弱，但I(xiàn)L-7能增強這種免疫反應(yīng)。盡管高效的抗病毒治療已顯著降低了HIV感染的發(fā)病率和死亡率，并且病毒被持續(xù)抑制，但大部分接受抗病毒治療的患者CD4+T細(xì)胞恢復(fù)較差。近期的研究證明，IL-7能夠通過提高幼稚T細(xì)胞和組織中的T細(xì)胞恢復(fù)，顯著提高HIV感染者的T細(xì)胞系統(tǒng)重建[6-7]。

位點特異重組可以克服隨機整合效率低等問題，其中酵母的FLP/FRT系統(tǒng)是常見的位點特異性重組工具，并被廣泛應(yīng)用。Invitrogen公司的Flp-In重組系統(tǒng)通過pOG44質(zhì)粒產(chǎn)生重組酶，將表達(dá)外源蛋白的pcDNA5/FRT整合于Flp-In-CHO細(xì)胞，該細(xì)胞在基因組活性區(qū)整合了相應(yīng)的FRT位點。在此，我們利用Flp-In-CHO細(xì)胞表達(dá)人IL-7，并對其相關(guān)功能做了初步研究，為其藥物開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Flp-In-CHO細(xì)胞、CellTrace CFSE Cell Prolif?eration Kit、pOG44質(zhì)粒、pcDNA5/FRT質(zhì)粒、F12培養(yǎng)基、牛血清、LipofectAMINE2000、潮霉素B購自Life Technology公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；T4DNA連接酶為Promega公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit、Endo-free Maxiplasmid Ex?traction Kit購自 Qiagen公司；Prestained Protein Marker購自博邁德生物有限公司；Human IL-7 ELISA Kit購自Abcam公司；人IL-7單克隆抗體購自R&D公司；流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司。

IL-7基因（GenBank：KJ891458.1）全長531 bp，編碼由177個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，使用linker加上CTP蛋白。按照CHO細(xì)胞密碼子偏嗜性進(jìn)行優(yōu)化，5'和3'端分別添加NheⅠ和NotⅠ酶切位點，由Life Technology公司合成。

1.2 表達(dá)載體構(gòu)建

按試劑盒說明書提取質(zhì)粒，用NheⅠ和NotⅠ分別酶切pGEM-T easy載體上的IL-7基因片段和pcDNA5/FRT質(zhì)粒，反應(yīng)體系50 μL，37℃水浴4 h，1.3%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，30 min）檢測。將IL-7基因片段和pcDNA5/FRT質(zhì)粒進(jìn)行膠回收，所得產(chǎn)物用于連接，反應(yīng)體系10 μL，4℃水浴過夜。將獲得的pcDNA5/FRT-IL-7表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后測序確認(rèn)，用 Endo-free Maxiplasmid Ex?traction Kit大提質(zhì)粒。

1.3 基因轉(zhuǎn)染和陽性細(xì)胞克隆的篩選

接種細(xì)胞至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日細(xì)胞約布滿85%，加入潮霉素B（終濃度依次為300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL）進(jìn)行篩選，培養(yǎng)10～14 d，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)測算潮霉素B殺傷Flp-In-CHO細(xì)胞的最小濃度。

將1×106Flp-In-CHO細(xì)胞鋪于6孔板上，待細(xì)胞鋪滿整孔90%時轉(zhuǎn)染。pcDNA5/FRT-IL-7-CTP和輔助質(zhì)粒pOG44按1∶9的摩爾比混合，將4 μg質(zhì)粒和 5 μL Lipo2000 分別稀釋于 250 μL optim-MEM培養(yǎng)基中，混合后，加入一孔用optim-MEM培養(yǎng)基洗滌過的CHO細(xì)胞中，共同孵育5 h后換成含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，24 h后轉(zhuǎn)入小瓶，用700 μg/mL潮霉素B加壓篩選，2～3周后獲得陽性克隆，將該陽性克隆細(xì)胞稀釋至約100/20 mL培養(yǎng)基后接種于96孔板，而后逐漸將單個細(xì)胞形成的克隆轉(zhuǎn)至24孔板和6孔板放大培養(yǎng)，收集上清。

1.4 間接免疫熒光法檢測細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白

將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞或單克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個新的24孔板，次日于4℃培養(yǎng)30 min后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞3次，每孔加入800 μL預(yù)冷的甲醇，-20℃固定細(xì)胞20 min，棄去甲醛液，用PBS洗細(xì)胞3次，每孔加入1∶1000稀釋的小鼠抗人IL-7單克隆抗體，37℃孵育1 h，棄去一抗，用PBS洗細(xì)胞4次，再加入1∶5000稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h，最后用PBS洗細(xì)胞4次，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 細(xì)胞染色體上整合的目的基因檢測和細(xì)胞穩(wěn)定性鑒定

按照核酸提取試劑盒說明書提取單克隆細(xì)胞核酸，使用特異性引物擴增。反應(yīng)體積為25 μL，包括50 pmol/μL 引物各 1 μL、5×反應(yīng)緩沖液 5 μL、dNTP 1 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL。反應(yīng)條件：94℃變性 5 min；94℃ 30 s，52℃30 s，72℃ 35 s，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行觀察。將單克隆細(xì)胞傳至5代和8代后提取核酸，用上述PCR方法檢測，驗證該插入片段是否依然存在。

1.6 Western印跡檢測IL-7的表達(dá)

將篩選獲得的單克隆細(xì)胞株擴大培養(yǎng)，收集5×106細(xì)胞煮沸，收集1.5 L細(xì)胞培養(yǎng)液上清，平均分成4份，分別進(jìn)行40%、50%、70%和80%硫酸銨飽和度沉淀，10 000 r/min離心30 min，收集4份沉淀，均將其用20 nmol/L PB和0.5 mol/L NaCl稀釋，并在該液體中透析后超濾濃縮，煮沸后進(jìn)行12%的SDSPAGE。采用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再將膜置于5%脫脂奶粉中，于4℃振蕩過夜；次日，依次加入小鼠抗IL-7單抗和HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，洗膜后，應(yīng)用TBM顯色。

1.7 IL-7表達(dá)水平檢測

取單克隆細(xì)胞24 h培養(yǎng)液稀釋至1/1000備用。將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品按1/3的梯度稀釋，用IL-7 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，加入終止液后，在酶標(biāo)儀上讀取D450nm值。

1.8 IL-7促外周血單核細(xì)胞增殖活性

抽取20 mL人靜脈血，用達(dá)科為公司外周血淋巴分離液試劑盒分離外周血單核細(xì)胞，用含10%FBS、10 mg/mL PHA-P的 1640培養(yǎng)液培養(yǎng) 5 d，PBS洗滌細(xì)胞，0.1%FBS/PBS重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞分為7管，每管1×106細(xì)胞（約250 μL）；用DMSO將5 mmol/L的CFSE稀釋至5 μmol/L后每管加入500 μL，37℃孵育10 min，用冰冷的FBS立即終止標(biāo)記10 min；離心洗滌2次，用含10%FBS的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，向b～f管分別加入IL-7；用正常Flp-In-CHO細(xì)胞培養(yǎng)24 h的上清稀釋R&D公司的IL-7作為對照，IL-7濃度分別為1、5和10 ng/mL，標(biāo)記為b、c、d管。上述ELISA定量的單克隆細(xì)胞上清，IL-7的終濃度也為1、5和10 ng/mL，標(biāo)記為e、f、g管。a管為PHA-P刺激，不加IL-7的陰性對照。IL-7刺激72 h后上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定

PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析表明片段大小符合預(yù)期。以BGH和CMV為引物測定表達(dá)載體上的目的片段，未見突變位點。PCR電泳圖與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞PCR鑒定電泳圖相似。見圖1。

2.2 潮霉素B篩選陽性細(xì)胞及單克隆化

用700 μg/mL潮霉素B篩選，約14 d后，經(jīng)96孔板單克隆化，鑒定獲得2株IL-7表達(dá)量較高的單克隆細(xì)胞株，分別命名為CHO-IL-7-C3和CHO-IL-7-D7。

2.3 單克隆細(xì)胞中整合的目的基因檢測和穩(wěn)定性檢測

收集單克隆細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，用QIAGEN公司核酸提取試劑盒提取核酸，以CMV和BGH為引物進(jìn)行PCR擴增（圖1）。細(xì)胞傳5～8代后，仍能在該細(xì)胞上檢測到目的基因（此部分電泳圖略）。

2.4 Western印跡檢測上清和細(xì)胞內(nèi)的目的蛋白

由于表達(dá)的是分泌蛋白，所以細(xì)胞內(nèi)IL-7含量較低，但通過Western印跡可以檢測到目的蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)硫酸銨沉淀濃縮后，可見目的蛋白主要集中在用40%～80%飽和硫酸銨沉淀中。見圖2。

2.5 IL-7表達(dá)水平測定

通過ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線測定，按照該試劑盒說明書計算，所篩選到的2株細(xì)胞的IL-7表達(dá)量為3～4 mg/L（具體數(shù)據(jù)略）。

2.6 IL-7-CTP蛋白促外周血單核細(xì)胞增殖活性

用CSFE標(biāo)記的外周血單核細(xì)胞經(jīng)不同濃度的CHO表達(dá)的IL-7和R&D公司的IL-7處理后，P3代細(xì)胞增殖情況見圖3，可見用CHO表達(dá)的IL-7的促外周血增殖能力明顯強于R&D公司的對照產(chǎn)品。

3 討論

病毒必須在細(xì)胞內(nèi)才能繁殖，在抗病毒的同時加上免疫治療具有很好的應(yīng)用前景，近年來在HIV多靶點治療方面取得了突破性進(jìn)展，其中最重要的經(jīng)驗是抗病毒治療與免疫治療的多靶向聯(lián)合治療，如IL-7和HIV疫苗抗病毒藥物聯(lián)合使用等[8]。IL-7是一種多能性的免疫調(diào)節(jié)劑，目前國際上正在進(jìn)行的相關(guān)臨床試驗就有20項，主要針對癌癥，如乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等[9-10]。所以，開展IL-7的表達(dá)、生物活性和功能的相關(guān)研究是非常必要的。

定點表達(dá)系統(tǒng)避開了隨機整合在非熱點區(qū)而導(dǎo)致表達(dá)量較低的缺陷，易于篩選，但要篩選到很高表達(dá)量的細(xì)胞株也非常困難。本實驗中，我們通過ELISA、PCR、Western印跡等方法，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選、穩(wěn)定傳代等多階段均證明了IL-7的表達(dá)，并進(jìn)行了定量。由于表達(dá)的IL-7是分泌蛋白，所以細(xì)胞內(nèi)的蛋白量較低，Western印跡檢測顯示條帶較弱。而經(jīng)過硫酸銨沉淀后，蛋白量得以富集，并且主要存在于40%～80%飽和硫酸銨溶液沉淀中，對下一步純化實驗較為有利。但還須進(jìn)一步篩選表達(dá)量更高的細(xì)胞株，為后續(xù)研究甚至生產(chǎn)奠定好的基礎(chǔ)。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT-IL-7的PCR（A）和酶切（B）鑒定

圖2 IL-7-CTP經(jīng)40%～90%硫酸銨沉淀（A）和單克隆細(xì)胞（B）的Western印跡M：蛋白marker；1：單克隆細(xì)胞CHO-IL-7-C3；2：單克隆細(xì)胞CHO-IL-7-D7；3：未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞

促外周血單核細(xì)胞增殖試驗結(jié)果表明，本研究獲得的IL-7在各濃度梯度均可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞增殖，且作用優(yōu)于R&D公司的IL-7?？赡苁且驗槲覀儾捎肅HO細(xì)胞表達(dá)體系，而對照品為原核系統(tǒng)表達(dá)。IL-7含有4個N糖基化和1個O糖基化位點，3個二硫鍵，原核系統(tǒng)表達(dá)時不能形成正確的糖基鏈，而在CHO細(xì)胞中經(jīng)過修飾后，可以形成正確的糖基化及空間結(jié)構(gòu)[11]，因此其功能要強于R&D公司的產(chǎn)品。

圖3 CHO培養(yǎng)上清和R&D公司的IL-7促外周血單核細(xì)胞增殖活性a：僅用PHA刺激；b、c、d：分別為1、5和10 ng/mL R&D公司的IL-7刺激；e、f、g：分別為1、5和10 ng/mL CHO培養(yǎng)上清的IL-7刺激

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