HPLC測定小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量

劉志海 黃 沛 夏高春

貴州省黔西南州食品藥檢驗(yàn)檢測中心，貴州 興義 562400

HPLC測定小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量

劉志海 黃 沛 夏高春

貴州省黔西南州食品藥檢驗(yàn)檢測中心，貴州 興義 562400

目的：建立小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量測定方法，為該藥材控制種植、加工、應(yīng)用提供的質(zhì)量控制。方法：采用HPLC法，以甲醇-0.1mol/L乙酸銨(85∶15)為流動相，在波長210nm處檢測小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的含量。結(jié)果：齊墩果酸在0.1989～1.2430mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9991，n=6)；加樣回收率為 95.6%，RSD為0.6 %。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性較好，可用于小花清風(fēng)藤的質(zhì)量控制。

小花清風(fēng)藤；高效液相色譜；齊墩果酸

小花清風(fēng)藤為清風(fēng)藤科植物小花清風(fēng)藤Sabia parviflora Wall. ex Roxb的莖和葉，俗稱小黃藥、黃腫藥、黃眼藥、雅希強(qiáng)，是布依族、苗族的常用藥物。主要分布于云南、廣西、貴州黔西南安龍、望謨、冊亨、惠水等地[1]；小花清風(fēng)藤味苦，性微寒，具有清熱利濕，清肝利膽，祛風(fēng)濕，消炎止痛的功效，臨床用于治療濕熱黃疸，風(fēng)濕骨痛，跌打損傷，肝炎。貴州少數(shù)民族用于治療肝炎具有很好的療效。《貴州植物志》記載，小花清風(fēng)藤制成的沖劑對甲肝患者治療的有效率達(dá)95%以上；對乙肝的治療效果也較顯著，其降黃疸和轉(zhuǎn)氨酶的效果極佳，用藥后約30%患者的表面抗原轉(zhuǎn)陰?，F(xiàn)代研究證明，小花清風(fēng)藤具有保肝、治療肝炎的作用[2]。小花清風(fēng)藤收載于2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，但標(biāo)準(zhǔn)僅有顯微和理化鑒別。小花清風(fēng)藤中含具有有護(hù)肝降酶的齊墩果酸[3-4]，研究在天然藥物化學(xué)的基礎(chǔ)上，結(jié)合小花清風(fēng)藤的功能主治，建立HPLC法測定小花清風(fēng)藤齊墩果酸含量的方法，旨在為苗藥小花清風(fēng)藤的資源開發(fā)及質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(含Empower色譜數(shù)據(jù)工作站)；AUY220萬分子一電子天平(日本島津)；賽多利斯CPA2250十萬分子一電子天平；電熱恒溫干燥箱(上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司)。

1.2 材料 齊墩果酸對照品(批號110709-201206，中國藥品生物制品檢定所，含量94.9%)；小花清風(fēng)藤采于貴州黔西南興義市滴水村。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18 (5um 4.6×250mm)； 流動相：甲醇-0.1mol/L乙酸銨(85:15)；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl；檢測波長：210nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸52.39mg(含量94.9%)，加甲醇定容至100ml量瓶中，制成每1ml含齊墩果酸0.4972mg的溶液，所得對照品圖譜見圖1。

2.3 供試品溶液的制備 取小花清風(fēng)藤藥材粉末4g，精密稱定，加入70%乙醇50ml，水浴回流2小時(shí)，取出，放冷；再用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，精密取25ml濾液置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?mol/L HCl 50ml使其溶解，加熱回流3小時(shí)，然后用三氯甲烷振搖提取4次(每次15ml)，合并三氯甲烷液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ葜?0mL，搖勻，取續(xù)濾液，即得。所得供試品圖譜見圖2。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別取齊墩果酸對照品4、8、10、15、20、25μl，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行HPLC分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=4.67×106X-1.54×104，r=0.9991(n=6)。結(jié)果表明齊墩果酸進(jìn)樣量在0.1989～ 1.2430mg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。具體見表1、圖3。

表1 線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗(yàn) 取齊墩果酸對照品(濃度為0.4792mg/ml)10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件下，測定齊墩果酸的峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積的平均積分值為2373089，RSD=0.7%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取小花清風(fēng)藤粉末(3號樣大莖)6份，按“2.3”項(xiàng)操作，制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積，測定齊墩果酸含量。結(jié)果齊墩果酸峰面積RSD為2.8%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取一份小花清風(fēng)藤粉末(4號樣大莖)，按“2.3”項(xiàng)操作，制備供試品溶液，室溫放置0、2、4、6、8、10h，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸峰面積的RSD為2.5%，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的(3號樣大莖)小花清風(fēng)藤藥材6份，每份約2g，分別加入10ml 0.4972mg/ml齊墩果酸對照品溶液，按2.3項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理后,按2.1項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積，測定齊墩果酸含量，計(jì)算加樣回收率。由表2可知，齊墩果酸的平均加樣回收率為95.6%，RSD為0.6%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.9 樣品含量測定 分別稱取6個(gè)批次的小花清風(fēng)藤粉末，按“2.3”項(xiàng)操作，平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行分析，記錄峰面積，測定藥材中齊墩果酸含量。結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

表3 樣品含量測定

3 討論

從表3可知，小花清風(fēng)藤樣品間齊墩果酸的含量存在一定差異，大莖葉中的齊墩果酸含量高于嫩莖嫩葉、小莖葉及中莖葉。藥材的莖葉生長年限越長，齊墩果酸的含量越高。說明在藥材選擇時(shí)偏向生長年限長，莖葉粗大的較好。

結(jié)合參考文獻(xiàn)[5]和齊墩果酸的化學(xué)特性，藥材采用70%乙醇50ml水浴回流2小時(shí)，加3mol/L鹽酸加熱回流3小時(shí)，用三氯甲烷萃取，合并三氯甲烷液，蒸干，甲醇定容。在吸收波長的選擇上，參考文獻(xiàn)[5-6]及通過DAD三微圖譜掃描軟件，齊墩果酸210nm波長處有較好吸收且雜峰較少基線較平，故選擇210nm為吸收波長。

流動相選擇時(shí)使用了甲醇-0.1mol/L乙酸銨(85∶15)、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(87∶13∶0.04∶0.02)，兩種流動相得到的齊墩果酸峰型都較好，供試品主峰都能與雜峰得到分離，因此參考2010版《中國藥典》(一部)翼首草含量測定的流動相選擇，故選擇甲醇-0.1mol/L乙酸銨作為流動相。

綜上所述，研究建立的HPLC測定小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的方法對齊墩果酸的分離較好，方法簡單，靈敏，精確度高，可作為小花清風(fēng)藤的質(zhì)量控制指標(biāo)。

[1] 貴州省藥品監(jiān)督管理局. 貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].貴陽：2003：57.

[2] 劉易蓉,邱曉春,陳惠.小花清風(fēng)藤保肝作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥房，2008,19(30)：2341.

[3] 林材，梁光義.清風(fēng)藤等中藥化學(xué)成分的研究[D].貴陽：貴州大學(xué)，2006.

[4] 林佳,郝小江,梁光義,等.小花清風(fēng)藤化學(xué)成分的研究[J].中草藥，1999,30(5):334-335.

[5] 劉易蓉，張永萍，梁光義，等.黔南小花清風(fēng)藤中齊墩果酸的提取工藝[J].中國中藥雜志.2006,31(16)：1373.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：358.

Content determination of oleanolic acid in Sabia parviflora by HPLC

LIU Zhihai HUANG Pei XIA Gaochun

Qianxinan food and drug testing Center，Xingyi 562400，China

Objective To establish a method to determine components in Sabia parviflora Wall. ex Roxb.,to improve its quality standard. And as the medicinal materials further to control the quality of the planting ang, processing, using the basis.Methods Using HPLC with the gradient elution of Methyl alcohol-0.1mol/L ammonium acetate solution(85∶15) detected the content of oleanolic acid at 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linear range in 0.1989～1.2430mg/ml(r=0.9991,n=6) , recovery was 95.6%;RSD was 0.6%.Conclusion The established method is simple, accurate, sensitive and, repeatability is good which, can be used for quality control of Sabia parviflora Wall. ex Roxb.

Sabia Parviflora; HPLC; Oleanolic Acid

劉志海(1982-),男，主管中藥師，研究方向：中藥、中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail:19889504@qq.com。

R284.1

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1007-8517(2015)19-0008-03

2015.06.24)