蒿芩清膽湯對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)影響研究

楊馥語，屈 杰，李 龍，黃彥銘，譚萬初

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610000)

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蒿芩清膽湯對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)影響研究

楊馥語，屈 杰，李 龍，黃彥銘，譚萬初*

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610000)

目的：觀察蒿芩清膽湯對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜核轉(zhuǎn)錄因子κB p65(NF-κBp6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響，探討其治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎(HAG)的作用機(jī)制。方法：按照性別、體重隨機(jī)抽取10只小鼠作為空白對照組，其余60只小鼠采用幽門螺桿菌(Hp)標(biāo)準(zhǔn)菌株(SS1)布氏肉湯液灌胃造模，建立Hp感染小鼠模型。造模成功后，將其隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為麗珠胃三聯(lián)組、三九胃泰組、模型組、蒿芩清膽湯高、中、低劑量組，每組小鼠灌服相應(yīng)藥液，空白組、模型組小鼠灌服等量生理鹽水，每天1次。2周后處死動(dòng)物，觀察各組小鼠胃黏膜病理改變，采用免疫組化法檢測其胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)情況。結(jié)果：與模型組比較，蒿芩清膽湯能顯著降低小鼠胃黏膜炎癥面積，降低胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：蒿芩清膽湯能減輕Hp感染小鼠胃黏膜炎癥，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κBp6炎癥通路激活，下調(diào)IL-8、iNOS過度表達(dá)有關(guān)。

蒿芩清膽湯；幽門螺旋桿菌；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；白細(xì)胞介素8；核轉(zhuǎn)錄因子

現(xiàn)代研究表明，H.pylori(Hp)感染是慢性胃炎、消化性潰瘍等多種常見胃腸道疾病的首要病因，且幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎(HAG)是非賁門部胃腺癌的癌前期病變[1]，因此根除H.pylori已成為當(dāng)前防治慢性胃病的重要方法和研究熱點(diǎn)。Hp的耐藥性以及藥物的副作用等因素嚴(yán)重影響了Hp的根除。中醫(yī)藥治療HAG具有癥狀緩解快、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。蒿芩清膽湯出自清代名醫(yī)俞根初的《重訂通俗傷寒論》，原方主治少陽濕熱痰濁證，具有清熱利濕、利膽和胃的功效，現(xiàn)代臨床多用于治療功能性消化不良、膽汁反流性胃炎、結(jié)石性膽囊炎等消化系統(tǒng)疾病[2]。本實(shí)驗(yàn)通過建立Hp感染小鼠胃黏膜損傷模型，采用免疫組化法檢測胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS的表達(dá)情況，探討蒿芩清膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用機(jī)理，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物

C57BL/6小鼠70只，SPF級(jí)，8～9周齡，平均體重20～25g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK(川)2013-24。

1.2 試劑

磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9062)；NF-κBp6試劑(武漢博世德生物工程有限公司，批號(hào)：BA0610)；IL-8(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-0780R)；iNOS抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZS-651)；幽門螺桿菌采用SS1(Sydney strain 1)菌株，培養(yǎng)液由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院提供。

1.3 儀器

2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國徠卡儀器有限公司)；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)； Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.4 藥物

蒿芩清膽湯(青蒿7g、黃芩10g、法半夏5g、竹茹10g、茯苓10g、陳皮5g、枳殼5g、滑石6g、青黛3g、生甘草1g)由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥房提供。中藥浸泡30min后用武火煎煮2次，再將湯汁熬成浸膏，高溫滅菌后備用。麗珠胃三聯(lián)(枸櫞酸鉍鉀片/克拉霉素片/替硝唑片)，由麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)。三九胃泰顆粒由三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體體表面積比進(jìn)行等效劑量換算，計(jì)算小鼠用藥量。

2 方法

2.1 造模方法

[3]，將SS1凍存菌株經(jīng)Skirrow’s選擇性及非選擇性培養(yǎng)基復(fù)蘇，于37℃微需氧條件下(O25%、CO210%、N285%)培養(yǎng)72h，采用布氏湯收集細(xì)菌，并調(diào)整濃度為1.0×109CUF/mL備用。小鼠禁食不禁水24h后，除空白組外，其余小鼠均先用5%碳酸氫鈉溶液0.2mL灌胃，30min后按照每次0.2mL/只的劑量，灌胃Hp菌液，連續(xù)4次，每次間隔48h?？瞻讓φ战M小鼠予以等量生理鹽水灌胃。于末次接種后第4周時(shí)禁食12h，處死小鼠，取3塊胃竇組織，一塊經(jīng)石蠟包埋，切片后經(jīng)W-S染色，進(jìn)行病理組織學(xué)及Hp檢測；一塊進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)；另一塊勻漿稀釋后進(jìn)行Hp培養(yǎng)，培養(yǎng)后將可疑菌落革蘭染色具有典型特征且觸酶試驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)以及尿素酶試驗(yàn)陽性者判定為Hp感染，其中有兩項(xiàng)陽性者，即說明造模成功。

2.2 分組與給藥

SPF級(jí)C57BL/6小鼠70只，平均體重20～25g，按性別、體重隨機(jī)取10只為空白組，其余動(dòng)物接種Hp造模，造模成功后按性別隨機(jī)分為A(模型組)、B(蒿芩清膽湯低劑量組4g·kg-1)、C(蒿芩清膽湯中劑量組8g·kg-1)、D(蒿芩清膽湯高劑量組16g·kg-1)、E(麗珠胃三聯(lián)組0.25g·kg-1)、F(三九胃泰組5.2g·kg-1)組，每組10只，雌雄各半，并作標(biāo)記?？瞻捉M和模型組小鼠以等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)過程中密切觀察小鼠一般情況，如毛發(fā)光澤度、體重變化、飲食情況、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)等，并觀察有無死亡情況。

2.3 取材方法

禁食24h后采用頸椎脫臼法處死小鼠并進(jìn)行解剖，將胃組織沿胃大彎側(cè)剪開，采用生理鹽水沖洗后，按組別放入裝有復(fù)合固定液的標(biāo)本瓶中固定，貼標(biāo)簽保存。分別進(jìn)行Hp檢測和胃黏膜病理學(xué)觀察，采用免疫組化法進(jìn)行NF-κBp6、IL-8、iNOS檢測，結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)比較每組小鼠陽性表達(dá)的平均光密度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

空白組小鼠在造模和給藥期間活動(dòng)正常、反應(yīng)靈敏、毛發(fā)光澤、飲食可，無死亡小鼠。其他各組中部分小鼠在造模后第2天起可見活動(dòng)量少、飲食減少、毛發(fā)稀疏、精神萎靡、倦臥，有部分小鼠死亡。

3.2 胃黏膜病理組織學(xué)觀察

空白組：黏膜單層柱狀上皮、腺體結(jié)構(gòu)完整，未見明顯炎細(xì)胞浸潤。模型組：小鼠胃竇部炎癥程度較重，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，可見較多炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主。與模型組比較，各治療組小鼠上述病變程度均有所減輕，其中以麗珠胃三聯(lián)組、蒿芩清膽湯高劑量組、三九胃泰組小鼠組織學(xué)改善最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

3.3 對胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)的影響

與模型組比較，三九組、麗珠組、蒿芩清膽湯高劑量組小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。蒿芩清膽湯低、中劑量組小鼠胃黏膜NF-κBp6、IL-8、iNOS表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、表3、表4。

表1 各組小鼠胃組織慢性炎癥病變程度及積分比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組比較，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△△P<0.01。

表2 各組小鼠胃組織 NF-κB p65平均光密度比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組相比，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各組小鼠胃組織IL-8平均光密度比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組比較，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△P<0.05。

表4 各組小鼠胃組織 iNOS平均光密度比較 (±SD)

注：模型組與空白對照組比較，**P<0.01；其余組與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

4 討論

H.pylori感染所致慢性胃炎屬于中醫(yī)學(xué)中“痞滿”“胃脘痛”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為H.pylori是外感濕熱之邪，慢性胃炎的主要病機(jī)為濕熱中阻、氣機(jī)不暢、胃失和降，臨床主要表現(xiàn)為口苦、咽干、惡心、干嘔、吐酸、上腹部脹滿不舒或疼痛，其病位主要在胃，但與脾、肝、膽密切相關(guān)。目前許多學(xué)者認(rèn)為Hp多為濕熱之邪，HAG患者在證候分布(臟腑氣血津液辨證)上以濕熱中阻(脾胃濕熱)證候?yàn)橹鱗4]，故治療應(yīng)以清熱利濕、利膽和胃為法。蒿芩清膽湯為清熱利濕、利膽和胃的代表方，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[5]，其具有抑制胃酸分泌、促進(jìn)胃排空，保護(hù)胃黏膜和止瀉等作用。臨床研究也亦證實(shí)蒿芩清膽湯對濕熱證之慢性胃炎具有顯著的治療效果[6]。

Hp感染人體后定植于胃黏膜，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。NF-κB是炎癥和免疫反應(yīng)過程中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，在黏膜炎癥和修復(fù)中具有重要作用，其中P65亞單位在 NF-κB基因轉(zhuǎn)錄活性中起主要作用[7]?，F(xiàn)代研究表明[8]，Hp感染誘導(dǎo)和激活胃黏膜NF-κBp，促使上皮細(xì)胞分泌IL-8等趨化因子，激活iNOS和其他炎癥介質(zhì)釋放，進(jìn)而損傷胃黏膜。此外，多種炎性細(xì)胞因子以及炎癥介質(zhì)都受到NF-κB的調(diào)控，如TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、集落刺激因子、白三烯等[9]。 已有資料表明[10-13]，Hp感染在誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞NF-κB 活化的同時(shí)，還可導(dǎo)致IL-8、TNF-α等水平升高；Hp感染誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞表達(dá)iNOS，這一作用也主要通過NF-κB 激活途徑介導(dǎo)。研究表明[14]，如果抑制NF-κB激活，iNOS的表達(dá)將會(huì)減少。因此，在治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎時(shí)，可通過中藥下調(diào)NF-κBp6表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κBp6激活來減輕胃黏膜炎癥程度。

本研究表明，蒿芩清膽湯可顯著降低Hp感染小鼠胃黏膜IL-8、iNOS表達(dá)水平，下調(diào)NF-κBp6表達(dá)，與三九胃泰、麗珠胃三聯(lián)治療效果接近，并對Hp感染所致胃黏膜損傷具有修復(fù)作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB P65表達(dá)，降低胃黏膜IL-8、iNOS過度表達(dá)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2014-10-10

四川省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013JY0110)

楊馥語(1988-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)內(nèi)科脾胃病。

譚萬初(1956-)，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)內(nèi)科脾胃病實(shí)驗(yàn)和臨床。

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0016-03

10.11954/ytctyy.201504008