HPLC法測定桑椹配方顆粒中槲皮素的含量

任菲菲，鄭艷青，馬 斐，張 靜，李智慧

(德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 德州 253020)

桑椹配方顆粒是以符合炮制的桑椹飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、濃縮、干燥、精制而成的顆粒［1］，具有生津止渴、補(bǔ)肝益腎、滋陰補(bǔ)血、烏須黑發(fā)、聰耳明目、延緩衰老、安神養(yǎng)心、潤腸通便等功效［2］。與傳統(tǒng)桑椹飲片相比桑椹配方顆粒即保持了傳統(tǒng)飲片的所有特征，又優(yōu)于傳統(tǒng)煎煮，藥效成分更加穩(wěn)定。便于服用、攜帶，在臨床用藥中可隨證組方［3］。近年來，配方顆粒在國內(nèi)外受到了廣泛追捧，但目前的標(biāo)準(zhǔn)都相對滯后，有必要對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

本文采用高效液相色譜法(HPLC)對桑椹配方顆粒中的槲皮素進(jìn)行了測定［4，5］，該法簡便、快速、重現(xiàn)性好，可以有效地對桑椹配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制，并為桑椹配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Model 9960D超聲波清洗機(jī);ML204電子分析天平;Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);在線真空脫氣機(jī)(G－1332A);高壓四元泵(G－1311A);紫外檢測器;Agilent 1200 Series色譜工作站;標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器(G－1329A);色譜柱恒溫箱(G－1316A);可變波長檢測器(G－1314B)。

1.2 試劑 槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):100081－200907);甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司);水為超純水，其余試劑為分析純;桑椹配方顆粒(三九藥業(yè)，1.5 g相當(dāng)于原藥材10 g;新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，1.4 g相當(dāng)于原藥材10 g;江陰天陰藥業(yè)，3 g相當(dāng)于原藥材10 g;湖南春江九匯股份有限公司，1.8 g相當(dāng)于原藥材10 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Krcomasil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);甲醇 －0.4%磷酸溶液(43∶57)［6］為流動(dòng)相;流速為1.0 mL·min－1;檢測波長為360 nm［7］;進(jìn)樣量 20 μL;柱溫 40 ℃。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)應(yīng)不低于4000;槲皮素其他雜質(zhì)峰的分離度R大于1.5。

2.2 對照品溶液制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含171.2 μg的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品適量，研細(xì)，取約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇超聲處理 30 min［8］，過濾，濾液加入 1.5 moL·L－1鹽酸溶液20 mL［9］，加熱回流 1 h，放冷，濾過，轉(zhuǎn)移至 50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，試液過0.45 μm膜，即得［10］。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取171.2 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL置100 mL容量瓶中，配置成濃度為1.712 μg·mL－1的槲皮素對照品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣 2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件，測定峰面積(色譜圖見圖1)。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得槲皮素回歸方程為Y=3078.3X－0.32，r=0.9997(n=6)。結(jié)果表明，槲皮素在0.003424～0.01712 μg線性關(guān)系良好。

圖1 槲皮素HPLC色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.4”項(xiàng)下的對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算，RSD為0.8%，表明精確度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取三九醫(yī)藥所產(chǎn)的同一批(批號(hào):141000W)桑椹配方顆粒6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按上述色譜條件測定，槲皮素的平均含量為 25.27 μg·g－1，RSD 為 2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.6”項(xiàng)下的同一供試品溶液 20 μL，隔 0、1、2、3、4、5 h 進(jìn)樣 6 次，以峰面積計(jì)算，RSD為0.8%，表明供試品溶液在5 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(三九醫(yī)藥，批號(hào):141000W，25.27 μg·g－1)，研細(xì)，取約 0.6 g，精密稱定，共取6份，分別精密加入10 mL槲皮素對照品(濃度為1.712 μg·mL－1)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，于上述色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1，表明本方法具有良好的回收率。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取不同廠家的桑椹配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

對流動(dòng)相進(jìn)行了考察，因加入適量的酸可以抑制槲皮素色譜峰的拖尾現(xiàn)象［11］，故選用甲醇－磷酸體系。分別對甲醇－0.2%磷酸溶液，甲醇－0.4%磷酸溶液流動(dòng)相體系進(jìn)行比較，結(jié)果表明甲醇－0.4%磷酸溶液分離效果較好?？疾旒状迹?.4%磷酸溶液不同的比例，結(jié)合峰型，分離度等因素，最終確定流動(dòng)相的比例為 43∶57。對 25、30、35、40 ℃ 等不同柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果表明40℃時(shí)槲皮素和其他雜質(zhì)峰能很好地分離且出峰快，最終確定柱溫為40℃。

對回流時(shí)間進(jìn)行了考察，樣品超聲過濾后分別加熱回流 15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h，按上述色譜條件檢測，結(jié)果表明1 h時(shí)桑椹配方顆粒中的槲皮素已水解提取較完全，隨加熱回流時(shí)間的延長，槲皮素反而有所損失，故確定回流時(shí)間為1 h。

隨著時(shí)代的發(fā)展，中藥配方顆粒越來越受到了大家的重視，在部分醫(yī)院已作為處方藥使用，但關(guān)于配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報(bào)道較少，建議加強(qiáng)對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的更新，尤其是多指標(biāo)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的研究［12］。

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［6］陳海霞，劉向紅，梁宏臣.HPLC法測定煙臺(tái)柴胡中蘆丁和槲皮素的含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(8):3382 －3383，3479.

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