山楂提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王玉團(tuán)，時(shí)海燕，徐 男，林 曉

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101;2.山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014;3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥分析重點(diǎn)學(xué)科，山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

山楂是薔薇科植物，具有藥食兩用的特點(diǎn)。作為中藥，其具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂之功效。主要用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、淤血經(jīng)閉、產(chǎn)后淤阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛、高脂血等癥。作為食品，其又廣泛應(yīng)用于食品和保健食品中，既可以增加食品的營(yíng)養(yǎng)性成分，又可以起到抗氧化的功效，具有廣闊的應(yīng)用前景。

山楂提取物目前僅有企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)項(xiàng)目不夠全面，且缺乏專屬性，故有必要對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。山楂提取物主要含有機(jī)酸類、黃酮類兩大功效成分，有機(jī)酸類物質(zhì)是消食導(dǎo)滯的主要有效成分，黃酮類物質(zhì)是防治心血管疾病、降血脂和抗氧化的活性成分，因此選擇有機(jī)酸、總黃酮為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。為更好地控制山楂提取物的質(zhì)量，又對(duì)提取物進(jìn)行了薄層色譜鑒別(TLC)及高效液相特征色譜法(HPLC － FP)研究［1～4］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Paragon E10xpress箱式電阻爐(美國(guó)Paragon公司);DGG－9070B電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);島津UV－2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);Mettler AE－240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);BK－600C超聲波清洗儀(巴克超聲設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥及藥品 蘆丁對(duì)照品［中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080－200707，紫外分光光度法(UV)含量為92.5%］;山楂對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):121138－200905);金絲桃苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111521－201004);牡荊素鼠李糖苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111668－200401);硅膠GF254(青島海洋化工廠分廠，批號(hào):20100808);枸櫞酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100396－200301);所用化學(xué)試劑均為分析純。

山楂提取物樣品:山西康立生藥業(yè)有限公司3批(鮮山楂提取)、陜西瑞康生物工程有限公司1批(干山楂切片提取)、實(shí)驗(yàn)室自制樣品2批，原料分別是從山西、山東收集到的山楂樣品，經(jīng)徐麗華主任藥師鑒定為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.的成熟果實(shí)。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 山楂提取物樣品信息匯總

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 對(duì)照藥材溶液的制備 取山楂對(duì)照藥材1.0 g，加水50 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 山楂提取物的TLC鑒別 吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷 － 甲醇 － 甲酸(10∶1∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視(見(jiàn)圖1)。供試品色譜中可見(jiàn)與山楂對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2 特征圖譜的研究［5，6］經(jīng)調(diào)研，山楂提取物的生產(chǎn)工藝均采用水煎煮法，有機(jī)酸類物質(zhì)是其主要成分，故山楂提取物的特征圖譜應(yīng)以有機(jī)酸類物質(zhì)為主進(jìn)行建立。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 固定相以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Thermo C18，4.6 mm×250 mm，5 μm);以 0.05 mol·L－1磷酸二氫銨(pH 2.5)為流動(dòng)相;流速為1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫:30℃。理論板數(shù)按枸櫞酸峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。進(jìn)樣量10 μL。

圖1 山楂提取物的薄層鑒別圖譜(溫度:25℃;濕度:55%)

2.2.2 參照品溶液的制備 取枸櫞酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品0.1 g，精密稱定，精密加入水25 mL，超聲使溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，以枸櫞酸峰為參照峰，比較各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD均小于0.96%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.2.5 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，分別于 0、1、2、4、12 h進(jìn)樣，進(jìn)行測(cè)定，比較各共有峰與參照物峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明各共有指紋相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD小于0.92%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性 取山西康立生藥業(yè)有限公司樣品0.1 g(1號(hào)樣品)，精密稱定，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于0.25%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。

2.2.7 樣品測(cè)定 取樣品1～6號(hào)各0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。

圖2 樣品HPLC－FP圖譜

表2 樣品特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間值

根據(jù)上述結(jié)果，理論板數(shù)按S峰(枸櫞酸峰)計(jì)算應(yīng)不低于6000，供試品特征圖譜應(yīng)呈現(xiàn)5個(gè)特征峰，各色譜峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為:0.53(峰 1)、0.60(峰2)、0.69(峰 3)、0.76(峰 4)、1.00(峰S)，應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍內(nèi)。

2.3 有機(jī)酸的含量測(cè)定［7］采用以酚酞為指示劑，酸堿滴定法測(cè)定有機(jī)酸的含量。

2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取枸櫞酸對(duì)照品適量，加水制成每1 mL含0.8704 mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，精密稱定，精密加入水100 mL，超聲使溶解，搖勻，過(guò)濾，即得。

2.3.3 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液50 mL，加水150 mL，加酚酞指示液5滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L－1)滴定，即得。每1 mL氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L－1)相當(dāng)于 6.404 mg的枸櫞酸(C6H8O7)。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品0.5 g，共6份，精密稱定，精密加入水100 mL，超聲使溶解，搖勻，過(guò)濾，即得。照“2.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果RSD為0.62%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品0.5 g，按照“2.3.2”制得供試品溶液，分別在 0.5、1、2、3、5 h即得。照“2.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果 RSD為0.62%。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取山楂提取物(山西1，批號(hào):01，水分為5.5%，有機(jī)酸含量為18.30%)的樣品約0.25 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液50 mL，精密加入水50 mL，超聲使溶解，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。照“2.3.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.7 含量測(cè)定 依據(jù)“2.3.3”項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表4。

根據(jù)上述6批樣品測(cè)定結(jié)果，暫定本品按干燥品計(jì)算，含有機(jī)酸以枸櫞酸(C6H8O7)計(jì)，不得少于15.0%。

2.4 總黃酮含量(UV 法測(cè)定)［8～11］

表4 有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(每1 mL中含蘆丁0.2 mg)。

2.4.2 供試品溶液的制備 取本品0.25 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，即得。

2.4.3 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液6 mL，置25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加50%甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外－可見(jiàn)分光光度法，在500 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密稱取蘆丁對(duì)照品13.88 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取 1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加50%甲醇至6 mL，照“2.4.3”項(xiàng)下方法，測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果蘆丁在濃度為0.01027～0.06163 mg·mL－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y=12.221X+0.01(r=0.9997)。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取山楂提取物(山西1，批號(hào):01)樣品0.25 g，精密稱重，共6份，分別置50 mL量瓶中，照“2.4.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量，RSD為1.27%。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取山楂提取物(山西1，批號(hào):01，水分為5.5%，總黃酮含量為11.80%)的樣品約0.12 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液25 mL(蘆丁濃度為0.5380 mg·mL－1)，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理，放冷至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。照“2.6.3”項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4.7 樣品的測(cè)定 精密稱取本品0.25 g，照“2.4.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，照“2.4.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果表6。

表6 含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)上述6批樣品測(cè)定結(jié)果，暫定本品按干燥品計(jì)算，含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計(jì)，不得少于8.0%。

3 討論

3.1 因該提取物生產(chǎn)的季節(jié)性很強(qiáng)，且儲(chǔ)藏條件要求較高，故各生產(chǎn)企業(yè)很少留樣，導(dǎo)致收集的批次受限，為保證所建立的特征圖譜的科學(xué)性，仍需進(jìn)一步收集樣品，繼續(xù)該項(xiàng)研究。

3.2 在特征圖譜的研究過(guò)程中，曾嘗試用甲醇－0.1%磷酸(5∶95)、0.05 mol·L－1磷酸二氫銨、0.05 mol·L－1磷酸二氫銨(pH=2.5)等多種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果甲醇－0.3%磷酸(5∶95)為流動(dòng)相色譜峰保留時(shí)間較小，不利于色譜峰的分離比較;用0.05 mol·L－1磷酸二氫銨為流動(dòng)相，枸櫞酸色譜峰有拖尾現(xiàn)象;用0.05 mol·L－1磷酸二氫銨(pH=2.5)為流動(dòng)相分離效果較好，保留時(shí)間較合適，且流動(dòng)相為緩沖鹽，便于控制流動(dòng)相的pH范圍，有利于提高有機(jī)酸類物質(zhì)色譜分離的重現(xiàn)性。

3.3 試驗(yàn)中曾采用HPLC法測(cè)定山楂提取物中金絲桃苷和牡荊素鼠李糖苷含量［12］，結(jié)果金絲桃苷含量在0～0.13%范圍內(nèi)，牡荊素鼠李糖苷含量在0.03%～0.10%范圍內(nèi)，各批次間差異非常明顯，且含量較低，故暫不列入標(biāo)準(zhǔn)正文。

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