烏骨藤總苷對SGC－7901、S180、P388腫瘤細胞的抑制作用研究

林耀才

(廣州醫(yī)科大學附屬深圳沙井醫(yī)院，廣東 深圳 518104)

烏骨藤為蘿藦科通關藤［Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.］的藤莖，性味苦，微寒，歸肺經(jīng)，具有止咳平喘，祛痰，通乳，清熱解毒等功效［1］。民間草醫(yī)常用于治療原發(fā)性肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤，具有一定的療效，且安全性較好。以其為原料制備的消癌平制劑廣泛用于肝癌、胃癌、食管癌、肺癌等腫瘤的治療［2～6］，具有療效好、毒性低的特點，可提高患者機體免疫力，改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長患者生存時間。烏骨藤含有甾體苷、生物堿、有機酸、多糖、樹脂及色素等化學成分，臨床用消癌平口服制劑均采用烏骨藤總提物入藥，存在服藥量大的不足。現(xiàn)代藥理分析表明甾體總苷可能是其輔助抗癌的主要成分，本文研究烏骨藤總苷對SGC－7901、S180、P388腫瘤細胞的抑制作用，為開發(fā)烏骨藤組分中藥抗癌新藥奠定基礎。

1 材料

1.1 藥物 烏骨藤總苷(自制，C21甾體苷類成分含量＞50%，批號:20130812);5－氟胞嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司，10 mL(0.25 g)/支，批號:1305052);羥喜樹堿注射液(黃石飛云制藥有限公司，2 mL(2 mg)/支，批號:130801);注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，0.2 g/支，批號:13011025)。

1.2 瘤株細胞 人胃癌細胞株SGC－7901細胞株、小鼠肉瘤S180細胞和淋巴白血病細胞P388細胞均購自中國科學院上海分院細胞生物研究所。

1.3 動物 SPF級昆明小鼠，雌雄各半，18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2013－0004。Balb/c裸鼠，雌雄各半，18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2013－0004。DBA/2小鼠，雌雄各半，18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2012－0002。

1.4 儀器 超凈工作臺(蘇州凈化設備公司);細胞培養(yǎng)箱(美國SHEL－LAB公司);酶標儀(美國Bio－Rad公司)。

2 方法

2.1 對人胃癌細胞SGC－7901的體外抑制試驗烏骨藤總苷組設高、中、低3個劑量組(劑量分別為15、12、9 mg·mL－1)，陽性對照組使用羥喜樹堿(劑量為0.001 mg·mL－1)，空白對照組給予生理鹽水，每組設10個復孔。取對數(shù)生長期的SGC－7901細胞，計數(shù)，采用RPMI－1640培養(yǎng)液配置細胞懸液(細胞數(shù)2.0×105·mL－1)，將上述細胞液加入96孔板，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中，加入MTT液，連續(xù)作用7 d，測定A值，計算各試驗組對SGC－7901細胞的抑制率。

抑制率=(對照組A540－治療組A540)/對照組A540×100%

2.2 對人胃癌細胞SGC－7901的體內(nèi)抑制實驗烏骨藤總苷組設高、中、低3個劑量組(劑量分別為240、180、120 mg·kg－1)，陽性對照組使用 5 － 氟胞嘧啶(劑量為0.025 mg·kg－1)，空白對照組使用生理鹽水，各組均采用腹腔內(nèi)注射方式給藥。取SGC－7901細胞(處于對數(shù)生長期)離心5 min(轉速1000 rpm)，然后濃縮至1 mL(含細胞4×107個)，先后加入纖維蛋白原和凝血酶液使之形成細胞凝塊，將其分割成等體積小塊。接種Balb/c裸鼠于前1 d腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺150 mg·kg－1，將瘤體接種于裸鼠腎囊下，瘤體移植后第2天開始連續(xù)給藥7 d，第8天將小鼠處死，測量腫瘤長徑和短徑，并計算腫瘤體積和腫瘤抑制率。

腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2［7］

腫瘤抑制率=(對照組腫瘤體積－用藥組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%

2.3 對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用 取6只健康昆明小鼠，雌雄各半，腹腔注射液體石蠟油(0.5 mL/只)，7天后于小鼠腹腔接種S180細胞(0.5 mL/只)，接種后9 d斷頸處死小鼠，于無菌條件下取出腹水，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次后制成細胞懸液，于實驗小鼠腋窩皮下接種0.2 mL(1×106個瘤細胞)細胞懸液，每批接種50只，接種后次日隨機分組，每組10只，烏骨藤總苷組設高、中、低3個劑量組(劑量分別為 540、270、135 mg·kg－1)，陽性對照組給予環(huán)磷酰胺(劑量為25 mg·kg－1)，空白對照組使用生理鹽水，各組均采用灌胃方式給藥，每天1次，連續(xù)10 d，于末次給藥后處死小鼠，稱體重，摘瘤稱重，計算抑瘤率。

2.4 對小鼠移植淋巴白血病細胞P388的抑制作用按常規(guī)方法［7］接種P388細胞懸液于DBA/2小鼠腹腔，每只小鼠接種0.2 mL(1×106個瘤細胞)，接種后次日隨機分組，每組10只，烏骨藤總苷組設高、中、低3個劑量組(劑量分別為540、270、135 mg·kg－1)，陽性對照組給予環(huán)磷酰胺(劑量為50 mg·kg－1)，空白對照組使用生理鹽水，各組均采用灌胃方式給藥，每天1次，連續(xù)10 d，記錄小鼠生存時間，計算生命延長率。

2.5 統(tǒng)計 統(tǒng)計方法采用兩組標本計量資料的t檢驗。

3 結果

3.1 對人胃癌細胞SGC－7901的體外抑制試驗烏骨藤總苷對SGC－7901細胞的抑制率呈劑量依賴關系，與空白對照組差異明顯:烏骨藤總苷高劑量組與空白對照組比較P＜0.001，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01。烏骨藤總苷高劑量組抑制率與羥基喜樹堿組相當，烏骨藤總苷組中低劑量組抑制率顯著弱于羥基喜樹堿，結果見表1。

表1 烏骨藤總苷對SGC－7901胃癌細胞生長抑制作用(，n=10)

表1 烏骨藤總苷對SGC－7901胃癌細胞生長抑制作用(，n=10)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與羥喜樹堿組比較，##P＜0.01

組別 藥物濃度(mg·mL－1) A540 抑制率(%)98烏骨藤總苷組空白對照組0.76 ±0.05 －15 0.03 ±0.02＊＊＊－9412 0.33 ±0.03＊＊ 58##90.58 ±0.09 26##羥喜樹堿組 0.001 0.01 ±0.01＊＊＊

3.2 對人胃癌細胞SGC－7901的體內(nèi)抑制實驗腹腔內(nèi)注射烏骨藤總苷對腫瘤的抑制率呈劑量依賴關系，各用藥劑量組的抑瘤率與空白對照組比較有顯著差異:烏骨藤總苷高劑量組與生理鹽水組比較P＜0.01，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01，烏骨藤低劑量組與空白對照組比較P＜0.05。烏骨藤總苷高劑量組抑瘤率與5－氟胞嘧啶組相當，烏骨藤總苷組中低劑量組抑瘤率顯著弱于5－氟胞嘧啶組。烏骨藤甾體總苷各組給藥后體重和毛色均無明顯改變，結果見表2。

表2 烏骨藤總苷對小鼠SGC－7901胃癌細胞的生長抑制(，n=10)

表2 烏骨藤總苷對小鼠SGC－7901胃癌細胞的生長抑制(，n=10)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與5－氟胞嘧啶組比較，##P＜0.01

組別 劑量(mg·kg－1) 腫瘤體積 抑制率(%)生理鹽水組10±3120 6±3* 49##烏骨藤總苷組78180 4.8 ±2.1＊＊ 54##240 2.7 ±2.1＊＊ 725 －氟胞嘧啶 0.025 2.5 ±1.4*

3.3 對小鼠移植肉瘤S180的抑制作用 結果表明，烏骨藤總苷對小鼠移植腫瘤S180有明顯抑制作用，與對照組比較具有顯著差異:烏骨藤總苷高劑量組與生理鹽水組比較P＜0.01，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01，烏骨藤低劑量組與空白對照組比較P＜0.05。烏骨藤總苷高中低劑量組抑瘤率顯著弱于環(huán)磷酰胺組，結果見表3。

表3 烏骨藤總苷對小鼠移植S180的抑制作用，n=10)

表3 烏骨藤總苷對小鼠移植S180的抑制作用，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;與環(huán)磷酰胺組比較，##P＜0.01

組別 劑量(mg·kg－1) 腫瘤重量(g) 抑瘤率(%)對照組1.88 ±0.45540 1.18 ±0.52＊＊ 36.25##烏骨藤總苷組80.11270 1.10 ±0.61＊＊ 40.18##135 1.29 ±0.55* 30.78##環(huán)磷酰胺 25 0.75 ±0.36＊＊＊

3.4 對小鼠移植淋巴白血病細胞P388的抑制作用 結果表明烏骨藤總苷對小鼠移植P388有顯著抑制作用，使小鼠生存時間延長，與對照組比較差異顯著:烏骨藤總苷高劑量組與生理鹽水組比較P＜0.01，烏骨藤中劑量組與空白對照組比較P＜0.01，烏骨藤低劑量組與空白對照組比較P＜0.05。烏骨藤總苷高中低劑量組生命延長率顯著弱于環(huán)磷酰胺組，結果見表4。

4 討論

烏骨藤含有多種甾體苷、生物堿、有機酸、多糖、樹脂及色素等化學成分［8～10］，研究表明C21甾體苷具有明顯的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［9］。烏骨藤中甾體苷包括通光藤苷 A、B、C、D、E、J、K 及通光藤新苷 A、B、C 等［9］，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，烏骨藤中C21甾體苷類具有誘導和促使微管(腫瘤細胞賴以分裂、擴散的載體)蛋白質(zhì)聚合、微管裝備與微管穩(wěn)定的獨特作用機制。

表4 烏骨藤總苷對小鼠移植P388的抑制作用(，n=10)

表4 烏骨藤總苷對小鼠移植P388的抑制作用(，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;與環(huán)磷酰胺組比較，##P＜0.01

組別 劑量(mg·kg－1) 生存時間(d) 生命延長率(%)對照組10.9 ±2.15540 15.8 ±3.12＊＊ 40.25##烏骨藤總苷組76.11270 14.8 ±2.61＊＊ 35.28##135 13.5 ±3.25* 28.78##環(huán)磷酰胺 50 18.8 ±2.86＊＊＊

臨床用消癌平片劑用法為每天3次，每次服8～10片，服用劑量太大，病人吞咽不方便，原因是現(xiàn)有烏骨藤口服制劑是以總提物入藥，工藝簡單、出膏率大、有效成分含量低導致，因而本研究擬對烏骨藤有效部位甾體總苷抗癌活性進行研究。消癌平制劑臨床用于治療食道癌、胃癌、肝癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、宮頸癌、卵巢癌等多種實體癌及白血病等療效顯著，基于烏骨藤制劑臨床所針對的腫瘤種類，本文選擇了人胃癌細胞SGC－7901、小鼠移植S180、小鼠移植P388進行體內(nèi)腫瘤抑制試驗。

烏骨藤總苷的體外和體內(nèi)試驗表明，烏骨藤總苷對SGC－7901胃癌細胞株有直接生長抑制作用，其體內(nèi)腫瘤抑制率呈劑量依賴關系，烏骨藤總苷高濃度組對SGC－7901體內(nèi)抑瘤率達到98%，作用與5－氟胞嘧啶相當。烏骨藤總苷對小鼠移植肉瘤S180的體內(nèi)試驗表明，雖然烏骨藤總苷抑瘤率與空白組有顯著差異，但烏骨藤總苷高中低3組的抑瘤率均弱于陽性藥環(huán)磷酰胺。小鼠移植淋巴白血病細胞P388的抑制試驗結果與肉瘤S180的體內(nèi)試驗類似，烏骨藤總苷抑瘤率與空白組有顯著差異，但烏骨藤總苷高中低3組對淋巴白血病細胞P388的體內(nèi)抑瘤率均弱于陽性藥環(huán)磷酰胺。實驗結果也與目前臨床上消癌平制劑治療胃癌相對具有較好療效的結果一致。

本文研究結果表明烏骨藤總苷對人胃癌細胞SGC－7901、小鼠移植S180、小鼠移植 P388均較顯著的體內(nèi)抑制作用，有望開發(fā)成為劑量小、攜帶服用方便的新一代烏骨藤有效部位抗癌新藥。

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