半邊旗提取物5F聯(lián)合5－Fu對A/J小鼠誘發(fā)性肺癌的影響

葉 華，劉 義，吳科鋒，李 立，鄭學(xué)寶

(廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023)

肺癌已成為我國惡性腫瘤首要的死亡原因，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%，且發(fā)病率和死亡率仍在繼續(xù)迅速上升，目前我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9%［1］。大量的流行病學(xué)研究證實吸煙與肺癌發(fā)生的密切關(guān)系，且我國吸煙人口正呈現(xiàn)年輕化、低齡化的趨勢。課題組證實半邊旗提取物5F(11α－羥基－15－氧－16－烯－對映貝殼杉烷－19－酸)對誘發(fā)性肺癌特別是由吸煙引起的肺癌具有較好的抑制作用［2］。我們進(jìn)一步觀察5F與5－氟尿嘧啶(5－Fu)聯(lián)合應(yīng)用對A/J小鼠誘發(fā)性肺癌的影響，探討5F與5－Fu聯(lián)合用藥的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 5F干粉由本實驗室(廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室)提供，經(jīng)丙二醇溶解，蒸餾水稀釋，制成丙二醇體積分?jǐn)?shù)為0.15%、5F質(zhì)量濃度為1000 mg·L－1的儲備液，除菌過濾后冷藏保存，實驗時再以培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(丙二醇最終濃度≤0.012)。A/J小鼠，6 周齡，體重 18～22 g，香港中文大學(xué)惠贈。5－Fu注射液，天津金耀氨基酸有限公司;B［a］P和NNK，購自Sigma公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒、血肌酐(Scr)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 小鼠誘發(fā)性肺癌模型的建立 除正常對照組以外，其余各組A/J小鼠均以3 μmol苯并［a］芘(B［a］P)和 3 μmol甲基亞硝胺吡啶基丁酮(NNK)制成的混合誘導(dǎo)劑進(jìn)行灌胃，每周1次，連續(xù)灌胃8周，誘發(fā)小鼠肺癌。

1.3 動物分組及給藥 AJ小鼠50只，隨機均分為5 組，正常組、模型組、5F 組(250 mg·kg－1)、5 －Fu組(25 mg·kg－1)和5F+5 －Fu組(5F 50 mg·kg－1+5－Fu 25 mg·kg－1)。從第9周開始，分別腹腔注射相應(yīng)藥物，模型組給予生理鹽水，連續(xù)給藥14周后處死小鼠。眼球眶靜脈采血，取肺、肝、腎等臟器檢測各項指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)和方法

1.4.1 體重 實驗期間每周稱取小鼠體重。

1.4.2 腫瘤數(shù)量 取出肺臟，計算肺臟的腫瘤數(shù)量。

1.4.3 臟器系數(shù) 取肝臟和腎臟組織，稱重，計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù) =臟器重量(g)/體重(g)×100。

1.4.4 肝腎功能 按照試劑盒說明書，檢測血清中ALT、AST、BUN 和 Scr的變化。

1.4.5 SOD和MDA檢測 按照試劑盒說明書，檢測血清中SOD和MDA的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，進(jìn)行單因素方差分析與析因設(shè)計方差分析，兩兩比較用方差齊選用LSD檢驗，方差不齊選用Tamhane's T2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 5F與5－Fu聯(lián)合用藥對NNK和B［a］P誘導(dǎo)A/J小鼠肺癌的影響 如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠體重略有下降，而5F組、5－Fu組和(5F+5－Fu)組小鼠體重略有升高。與模型組比較，5F和5－Fu聯(lián)合用藥，或者分別單獨給藥均能降低小鼠腫瘤數(shù)量，差異有顯著意義，其中(5F+5－Fu)組腫瘤抑制率最高，達(dá)44.36%。5F可以增強5－Fu的治療效果，兩者聯(lián)合用藥具有協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果見表1。

表1 5F和5－Fu聯(lián)合應(yīng)用對NNK和B［a］P誘導(dǎo)A/J小鼠肺癌的影響

圖1 5F與5－Fu聯(lián)合用藥對誘發(fā)性肺癌小鼠體重的影響

2.2 5F和5－Fu聯(lián)合應(yīng)用對肺癌小鼠肝臟、腎臟系數(shù)和肝腎功能的影響 如表2所示，與模型組比較，各給藥組肝臟和腎臟系數(shù)沒有明顯變化。血清ALT檢測結(jié)果顯示，5F不影響ALT水平，5－Fu組ALT水平升高，但5F與5－Fu聯(lián)合應(yīng)用可降低ALT水平，與5－Fu組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。血清AST檢測結(jié)果顯示，模型組AST水平升高，5F組和(5F+5－Fu)組AST水平較模型組降低(P＜0.05或P＜0.01)。血清BUN和Scr檢測結(jié)果各組之間沒有顯著差異，結(jié)果見表3。

表2 5F和5－Fu聯(lián)合應(yīng)用對肺癌小鼠臟器系數(shù)的影響

2.3 5F和5－Fu聯(lián)合應(yīng)用對肺癌小鼠血清SOD和MDA的影響 模型組SOD水平較正常組降低，5F和5－Fu聯(lián)合或者分別單獨給藥均能提高SOD水平，與模型組比較有顯著性差異。對血清MDA水平的檢測結(jié)果顯示各組無明顯差別，結(jié)果見表4。

表3 5F和5－Fu聯(lián)合應(yīng)用對肺癌小鼠血清ALT、AST、BUN 和 Scr的影響

表4 5F和5－Fu聯(lián)合應(yīng)用對肺癌小鼠血清SOD和MDA的影響

3 討論

在世界范圍內(nèi)，肺癌是所有惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤［3］。吸煙是肺癌公認(rèn)的最主要的致病因素，B［a］P和NNK是香煙煙霧所含的主要致癌物質(zhì)［4，5］。Hecht等［6，7］利用 B［a］P 和 NNK 為誘導(dǎo)劑建立的A/J小鼠肺癌模型，其肺癌形成的機制跟人類有很大相似性，是研究人類肺癌尤其是吸煙引起肺癌的首選模型。因此本研究利用更接近于人體腫瘤生長狀態(tài)的A/J小鼠誘發(fā)性肺癌模型來探討5F與5－Fu聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)的抗腫瘤活性。

5F是從生長在我國南方的傳統(tǒng)中草藥半邊旗中分離得到的一種具有抗腫瘤活性的二萜類化合物［8］。前期的研究證實，在體外5F能抑制 NCIH460、NCI－H23、A549和 CRL－2066等肺癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，在體內(nèi)5F顯著降低NNK誘導(dǎo)的肺癌數(shù)量和大小，且對肝腎功能無明顯毒副作用［9，10］。5－Fu 是臨床常用的抗腫瘤藥物，常用于治療肺癌、腸癌、胃癌等多種癌癥，因此，我們將5F與5－Fu合用，探討兩者聯(lián)合應(yīng)用的可行性。

我們的研究結(jié)果表明，5F和5－Fu聯(lián)合用藥可以顯著降低B［a］P和 NNK誘導(dǎo)的A/J小鼠肺癌數(shù)量，腫瘤抑制率達(dá)44.36%，與單獨使用5F或5－Fu相比，聯(lián)合用藥具有協(xié)同效應(yīng)。對肝臟和腎臟系數(shù)，血清ALT、AST、BUN和Scr的檢測顯示，對肝腎功能沒有明顯毒副作用，而且能降低5－Fu導(dǎo)致的ALT和AST升高。此外，5F和5－Fu聯(lián)合還顯著提高SOD的水平。這些結(jié)果均提示，可以在臨床上將5F與5－Fu聯(lián)合應(yīng)用治療肺癌。然而，目前對于5F與5－Fu協(xié)同抗肺癌作用的機制尚不清楚。吸煙所誘發(fā)的肺癌會導(dǎo)致K－ras、NF－κB和 p53等基因的改變［11］，在這些分子中，已知5F的抗癌作用與調(diào)節(jié)NF－κB信號通路和影響p53基因有關(guān)，5F與5－Fu的協(xié)同效應(yīng)是否與這些分子有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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