高效液相色譜法測定蕎麥中蘆丁含量

穆志新 ，田 翔 ，周建萍 ，師 穎

（1.山西省農業(yè)科學院農作物品種資源研究所，農業(yè)部黃土高原作物基因與種質創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；2.山西省農業(yè)科學院農產品質量安全與檢測研究所，山西太原030031）

蕎麥最早起源于我國，栽培歷史悠久，種植經驗也很豐富。蕎麥味道清香，在日本、朝鮮、韓國以及我國的東北、華北等地區(qū)都是很受歡迎的食品[1-2]。蕎麥是一種獨特的藥食兩用作物，其營養(yǎng)價值和藥用價值豐富。利用蕎米和蕎麥面粉直接加工可以制作成面條、烙餅、涼粉、灌腸等地方特色小吃。蕎麥性甘味涼，含有非常豐富的天然生物活性成分黃酮類物質——蘆丁。蘆丁又稱維生素P，屬于維生素類藥，能夠有效地降低毛細血管的通透性和脆性，從而保持和恢復毛細血管的正常彈性；還可用于防治高血壓、腦溢血、糖尿病、視網膜出血和出血性紫癜等，也可用作食品抗氧化劑和色素。此外，蘆丁還是心腦血管用藥合成曲克蘆丁的主要原料，而曲克蘆丁能有效地抑制血小板的聚集，防止血栓的形成。

蕎麥中蘆丁含量的高低影響著蕎麥的品質。因此，本試驗研究一種檢測蕎麥中蘆丁含量的有效方法[3-4]，旨在為進一步選育高蘆丁含量的蕎麥品種以及將其用于醫(yī)藥工業(yè)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品

供試苦蕎樣品由山西省農業(yè)科學院農作物品種資源研究所蕎麥課題組育種專家提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀，美國安捷倫科技；AS10200AT超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯；BSA2202S分析天平，德國賽多利斯；Eppendorf5804R高速離心機，德國艾本德股份公司；DirectQ-3超純水機，美國Millipole；DHG-9140AS電熱鼓風干燥箱，寧波東南儀器有限公司。

甲醇色譜純：Fisher Scientific；標準品蘆?。兌?8%）：Sigma；磷酸二氫鉀優(yōu)級純：國藥集團；水為超純水。

1.3 色譜條件

安捷倫 C18柱（4.6mm×150 mm，5μm），柱溫為30℃，甲醇∶0.5%磷酸（V/V）＝40∶60作為流動相，流速為1mL/min，進樣量是5μL，檢測波長為204 nm。

1.4 標準工作曲線

精密稱取干燥的蘆丁標準品10mg，加入甲醇定容至10mL，制成質量濃度為1mg/mL的儲備液[5]。再將標準品稀釋成 50，100，200，300，400μg/mL的質量濃度梯度。圖1為蘆丁標準品的高效液相色譜圖，保留時間為3.475min[6-8]。

1.5 樣品處理

取樣10 g，置于40℃烘干箱中鼓風干燥4 h，立即放入旋風磨中粉碎，并全部通過0.177mm篩，備用。取制備好的試樣0.10 g于2mL離心管中，加1mL甲醇振蕩混勻，水溫60℃超聲萃取1 h，再以4 000 r/min的速度離心10 min，收集上清液，重復2次，并將2次提取液合并到25mL容量瓶中，用0.1mol/L磷酸調pH值至6左右，定容。過0.22μm有機濾膜備用[9-10]。

2 結果與分析

2.1 校準曲線的繪制與樣品測定[11-13]

取1.4配制的系列標準混合工作溶液，質量濃度按從低到高順序分別進樣5μL，以標準工作溶液質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制校準曲線。同時取萃取好的待測樣液過濾后進樣5μL，記錄峰面積。從工作曲線上查出待測各組分的質量濃度，根據稀釋倍數，計算被測樣品中各組分的百分含量。結果表明，蘆丁標準品含量在50.0～400.0μg/mL范圍內呈線性關系（圖2），按照標準品質量濃度（x）與對應的色譜峰面積（y）得到線性方程：y＝10.946x－247.2（R2＝0.999 7）。

2.2 樣品含量測定

按照1.5的方法處理蕎麥樣品，并且按照1.3的色譜條件進行分析，記錄峰面積。根據濃度、稀釋倍數以及樣品的重復，計算得出蕎麥中的蘆丁含量。可以根據苦蕎蘆丁含量篩選出蘆丁高含量苦蕎種質資源[14]（表1）。圖3為蕎麥樣品蘆丁含量色譜圖。

表1 24份核心種質資源蘆丁含量

2.3 方法的精密度和回收率測定

稱取0.1 g的蘆丁質量分數為20.5mg/kg的蕎麥樣品6份，分別按照3個質量分數水平50，80，100mg/kg加入標準溶液，按本試驗方法進行提取和測定（每個添加水平平行測定6次），計算平均加標回收率和相對標準偏差[15]。從表2可以看出，平均加標回收率介于97.2%～104.1%之間，相對標準偏差介于1.8%～2.3%之間，說明該方法準確、穩(wěn)定、可靠。

表2 精密度和回收率測定結果

2.4 穩(wěn)定性試驗

12 h內每隔2 h對蕎麥進樣一次，記錄峰面積，結果顯示，供試樣品峰面積的相對標準偏差為2.1%，表明樣品的穩(wěn)定性較好。

3 討論

之前的研究往往采用60%～70%的乙醇或甲醇提取蕎麥中的蘆丁。在本試驗中，采用流動相甲醇來提取蕎麥中的蘆丁，相比于用乙醇提取蘆丁，該方法提取樣品的穩(wěn)定性以及試驗的重復性都更好。在用高效液相色譜法檢測蘆丁的含量時，主要是通過控制流動相比例及檢測波長來優(yōu)化試驗條件[16]。近年來，隨著生活水平的不斷提高，人們越來越注重食品的功能性，即食品的保健作用，作物育種工作的熱點也隨之向功能育種轉變。種質資源是育種工作的物質基礎，同樣功能育種也需要發(fā)掘特異性狀優(yōu)良的種質。對所搜集的核心種質進行蘆丁含量測定，篩選出蘆丁高含量和高產量的蕎麥種質，以期為蕎麥功能育種提供依據。

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