百靈安神片微生物限度檢查方法驗(yàn)證

摘要：建立百靈安神片的微生物限度檢查方法。方法按照《中國(guó)藥典》2010版微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)論本品可采用培養(yǎng)基稀釋法檢查細(xì)菌數(shù)，采用常規(guī)法檢查霉菌及酵母菌數(shù)，可操作性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：百椹安神片；微生物限度檢查；抑菌作用

百靈安神片主要含有制何首烏、酸棗仁（炒）、桑椹、靈芝、百合、知母、丹參、菊花、茯苓、合歡花等多種成分。其中多味中藥材含有抑菌成分，可抑制污染的微生物生長(zhǎng)，這就給藥品造成了安全隱患，因此為了更好而有效的保障該藥品的質(zhì)量，我們根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄[1]的要求對(duì)百靈安神片進(jìn)行了微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證，以期獲得更具科學(xué)性和準(zhǔn)確性的微生物限度檢查方法，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 藥物與試劑

1.1樣品 百靈安神片（批號(hào)130901-1，130901-2，130901-3）石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20120802）；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：121027）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20121211）；膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)：1204232）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：120913）；改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：120216）；乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（批號(hào)：20120412）；曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1301262）；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（批號(hào)：120423）；乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（1206214）；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

來(lái)源：中國(guó)藥品生物制品檢定所

1.3菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]；大腸埃希菌[CMCC（B）44102]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；乙型副傷寒沙門(mén)菌[CMCC（B）50094]，以上培養(yǎng)基和菌種由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.4儀器 生化培養(yǎng)箱：LRH-250F上海一恒儀器有限公司；生物安全柜：美國(guó)Frontline；菌落計(jì)數(shù)器：XK97-A 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；超速離心機(jī)：LD4-1.8型 北京京立離心機(jī)有限公司。

2 菌液及供試品的制備

2.1菌懸液的制備 ①取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，10倍稀釋至50～100cfu/ml，備用；②取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物，10倍稀釋成50～100cfu/ml，備用；③取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)5～7d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液，備用；

2.2供試品制備 稱取樣品10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml制成1：10的供試液

3細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

取規(guī)定量1：10供試液和上述制備好的陽(yáng)性對(duì)照菌液1ml置平皿中，加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，放置凝固后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率：

3.1平皿法 取1：10供試液1ml/皿

3.2培養(yǎng)基稀釋法 取1：10供試液2ml，每1ml供試液等量分注5個(gè)平皿，每5個(gè)平皿為一組，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)。另外取1ml供試液和白色念珠菌、黑曲霉陽(yáng)性對(duì)照菌液1 ml注入平皿中，做2個(gè)平行樣，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1

3.3計(jì)算回收率 試驗(yàn)組：按上述三種方法取1：10供試液，分別污染50～100cfu/ml的試驗(yàn)菌株，立即傾注細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d觀察結(jié)果：菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)；供試品對(duì)照組：測(cè)定供試品的本底菌數(shù)；稀釋劑對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組。

4結(jié)果與分析

見(jiàn)表1～表3。

由表1可知：五株試驗(yàn)菌適宜稀釋度菌懸液菌落個(gè)數(shù)都在50～100cfu，因此符合微生限度檢查方法驗(yàn)證用菌種稀釋度要求。

5控制菌檢查方法驗(yàn)證

見(jiàn)表4～表6。

從表4、表5、表6可以看出：該供試品控制菌檢查可采用1：10供試液進(jìn)行控制菌檢查。

本品按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄[1]檢查，由以上試驗(yàn)結(jié)果得：按供試品制備方法稱取10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml制成1：10的供試液，細(xì)菌限度檢查采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿），霉菌及酵母菌限度檢查采用常規(guī)法；控制菌限度檢查采用常規(guī)法。

6討論

中藥制劑含有多種成分，其中部分成分具有一定的抑菌作用，給中成藥微生物含量檢測(cè)帶來(lái)一定困難。采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，將影響微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)患者安全用藥埋下隱患。

通對(duì)本品的微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證可知：建立了百靈安神片的微生物檢查方法，可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）進(jìn)行細(xì)菌限度檢查，可采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌及酵母菌限度檢查；采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌限度檢查。解決了藥物抑菌成分的存在對(duì)微生物限度檢查產(chǎn)生的干擾，能夠真實(shí)、客觀地反映藥物的染菌情況，使檢查結(jié)果科學(xué)、準(zhǔn)確、可信。在處方、生產(chǎn)工藝及檢測(cè)環(huán)境不變的情況下，可按上述驗(yàn)證后的方法進(jìn)行本品的微生物限度檢查。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-88.

編輯/王海靜