替格瑞洛對ox—LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞vWF表達(dá)的影響

摘要：目的 探討不同濃度的替格瑞洛（Tigeralor）對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）血管性假血友病因子（vWF）表達(dá)的影響。方法 離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以1×10/ml接種于6孔培養(yǎng)板，200ul/孔，待細(xì)胞生長到融合狀態(tài)時(shí)取三孔加人ox-LDL （50ug/m1），處理24h后分別加入不同濃度的替格瑞洛（0、20及40umol/L）再作用24h。然后采用Western Blot法測定vWF的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 ox-LDL可增加vWF的蛋白表達(dá)；替格瑞洛可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs vWF的蛋白表達(dá)，并呈濃度依賴性。

關(guān)鍵詞：氧化型低密度脂蛋白；替格瑞洛；血管性假血友病因子；血管內(nèi)皮細(xì)胞；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

已有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell， VEC）的損失及功能紊亂與多種疾病密切相關(guān)，包括冠心病、高血壓、腦卒中、糖尿病等[1]。目前vWF被認(rèn)為是反映VEC功能的最好指標(biāo)[2]。ox-LDL可造成內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷，引起vWF高表達(dá)。替格瑞洛（Ticagrelor）是一種新型抗血小板藥物，在它發(fā)揮抗血小板作痛的同時(shí)，是否還具有改善血管內(nèi)皮功能的作用，本研究將進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由天津市心血管疾病研究所贈(zèng)與，培養(yǎng)基為含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM-F12。

1.1.2主要試劑 DMEM-12培養(yǎng)基，GIBC，美國；FBS，Hyclone，美國；替格瑞洛原粉，上海鉑力生物科技有限公司，上海；vWF抗體，北京中原領(lǐng)先科技有限公司；氧化型低密度脂蛋白，北京欣源佳和生物科技有限公司；ImmobilonTM Western chmiuminescent HRP，MILLIPORE，USA；鼠抗ICAM-1單抗，北京中山金橋，北京；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，Abcam，USA；鼠抗GAPDH單克隆IgG，Abcam，USA。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司，江蘇；Eppendorf低溫離心機(jī)，eppendorf，德國；細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo Forma，USA；6孔培養(yǎng)板，Corning，USA；微量移液管，Brand accu-jet，USA；紫外可見光分光光度計(jì)，Eppendrof，USA；電子天平，北京多賽斯儀器系統(tǒng)有限公司；電轉(zhuǎn)膜儀，Becton，Dickinson and Company， USA；水平搖床，Becton，Dickinson and Company，USA。

1.2方法

1.2.1 HUVECs的培養(yǎng)及處理 對凍存的HUVECs株進(jìn)行復(fù)蘇及傳代，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞傳代培養(yǎng)2～3代后，將狀態(tài)良好的細(xì)胞平均分裝于6孔板內(nèi)，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，待6孔板細(xì)胞生長到融合狀態(tài)時(shí)，加入ox-LDL及替格瑞洛進(jìn)行刺激和干預(yù)。分組如下：1組：培養(yǎng)基1ml，替格瑞洛0；2組：培養(yǎng)基1ml，替格瑞洛20ul（20umol/ml）；3組：培養(yǎng)基1ml，替格瑞洛40ul（40umol/ml）；4組：培養(yǎng)基1ml，oxLDL38ul（50ug/ml），替格瑞洛0；5組：培養(yǎng)基1ml，oxLDL38ul（50ug/ml），替格瑞洛20ul（20umol/ml）；6組：培養(yǎng)基1ml，oxLDL38ul（50ug/ml），替格瑞洛40ul（40umol/ml）。其中1～3組為非ox-LDL誘導(dǎo)組，4～6組為ox-LDL誘導(dǎo)組。將六孔板置于恒溫37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.2蛋白定量及分析 細(xì)胞經(jīng)過刺激干預(yù)24h后，提取蛋白，采用WesternBlot進(jìn)行蛋白定量經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、曝光后獲得膠片，膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)對目的條帶和GAPDH（持家基因內(nèi)參）條帶進(jìn)行攝像，測量條帶的灰度值；比較各組件校正后的蛋白條帶灰度值的關(guān)系，并以未經(jīng)刺激干預(yù)組為標(biāo)準(zhǔn)值，計(jì)算各組條帶的相對灰度值并繪制柱狀圖（圖1）。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

WesternBlot蛋白定量結(jié)果顯示（圖1），ox-LDL誘導(dǎo)組vWF的蛋白表達(dá)明顯高于對應(yīng)的非誘導(dǎo)組（P<0.05）；未予替格瑞洛干預(yù)組vWF的蛋白表達(dá)高于替格瑞洛低濃度組（P<0.05），替格瑞洛低濃度組vWF的蛋白表達(dá)高于替格瑞洛高濃度組（P<0.05）。

實(shí)驗(yàn)分組

Vwf

GAPDH

圖1 vWF的蛋白表達(dá)

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是心腦血管疾病和糖尿病血管病變發(fā)病共同的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中，內(nèi)皮細(xì)胞損傷及內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的NO、vwF、ET等對疾病的發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用[3]，抑制這些因子的釋放可有效延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。內(nèi)皮細(xì)胞參與體內(nèi)多種重要的平衡調(diào)節(jié)及細(xì)胞功能調(diào)控，既作為各種外界刺激和體液介質(zhì)的靶細(xì)胞，本身又具有非?；钴S的代謝功能，通過分泌多種活性物質(zhì)維持血管的舒縮狀態(tài)，調(diào)節(jié)器官血流的同時(shí)對血液凝固、白細(xì)胞活性及血小板聚集在臟器的缺血、炎癥、免疫等反應(yīng)過程中具有重要作用。vWF是VEC和巨核細(xì)胞分泌的、在正常凝血過程中發(fā)揮重要功能的一種多聚體糖蛋白，貯存在VEC的Weibel palade小體中，其多聚化程度的精確調(diào)控對維持正常的生理作用十分重要。當(dāng)VEC活化或損傷時(shí)，將vWF釋放進(jìn)人血中，由于vWF幾乎僅由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，因此該指標(biāo)水平的變化可敏感反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷、異常活化或功能障礙的存在。在病理情況下，vWF不但參與高凝狀態(tài)的形成，同時(shí)各類病理因素對于血管內(nèi)皮的復(fù)雜影響也最終反映在血漿中vWF的水平變化上，所以vWF水平與病情發(fā)展趨勢密切相關(guān)，而這一特點(diǎn)對于臨床監(jiān)測與評估尤為重要。

本研究顯示：ox-LDL可誘導(dǎo)HUVECs vWF的表達(dá)，替格瑞洛可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs vWF的表達(dá)，且呈濃度依賴性。替格瑞洛在發(fā)揮抗血小板作用的同時(shí)，能夠抑制vWF的表達(dá)，具有改善血管內(nèi)皮功能的作用，進(jìn)而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，可能改善患者預(yù)后，為臨床提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/哈濤