XAGE—1b基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)的研究

摘要：目的 研究肝癌細(xì)胞中XAGE-1b基因的表達(dá)。方法 以64例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織為研究對象，通過Real-timePCR法進(jìn)行檢測和分析。結(jié)果 XAGE-1b基因在肝癌組織與在癌旁組織中表達(dá)值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 XAGE-1b可作為肝癌診斷的標(biāo)記物，建議與AFP檢測聯(lián)合應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：肝癌；XAGE-1b；PCR；表達(dá)

Abstract：Objective To study the expression of XAGE-1b in hepatoma cancer.Methods Take the cancerous tissue and para-cancer tissue in 64 cases of PHC as the research objects，employ the method of real time quantified PCR to study the expression of XAGE-b in PHC.Results The expression of PHC was higher than in para-cancer tissue （P<0.05）.Conclusion XAGE-1b may serve a valuable target in monitoring of PHC，suggest that XAGE-1b work together with AFP will be better.

Key words：Hepatoma cancer； XAGE-1b；Expression

原發(fā)性肝癌（PHC）病情危重，發(fā)病率較高，目前關(guān)于該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，普遍認(rèn)為與肝硬化、病毒性肝炎和黃曲霉素等致癌物質(zhì)、環(huán)境因素有關(guān)，患者表現(xiàn)有肝區(qū)疼痛，消瘦乏力，食欲不振等癥狀，而近年來針對原發(fā)性肝癌研發(fā)了多種治療的新技術(shù)和新方法，但仍有60%左右的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以往肝癌檢查都是采用肝癌學(xué)前標(biāo)記物如AFP檢測，或者影像學(xué)檢查，存在一定的不足之處，本實驗旨在通過RT-PCR法分析XAGE-1b在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，來確定XAGE-1b能否作為PHC診斷及預(yù)后的依據(jù)。

1資料與方法

1.1儀器與試劑 熒光實時定量PCR反應(yīng)儀：Ftc-2000（上海楓嶺生物技術(shù)公司）；微量移液器（Gilson公司）；離心機(jī)（Eppendorf5415D）；凝膠成像分析儀（上海復(fù)日公司）；石蠟切片機(jī)（RM2145，LEICA公司）；試劑盒（上海近岸科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州泛思生物技術(shù)科技有限公司）；普通PCR反應(yīng)試劑（包括Tap酶、dNTP，Buffer等）（上海申能博采公司）。TaqMan-MGB熒光探針及其相應(yīng)的PCR反應(yīng)引物（上?；瞪锛夹g(shù)公司）。

1.2標(biāo)本來源 2010年10月～2014年10月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的病理證實為原發(fā)性肝癌患者共64例，其中男38例，女26例，年齡34～72歲，分別取手術(shù)切除30 min內(nèi)的癌組織和癌旁組織（距肝癌組織>1 cm）為樣本，置于預(yù)裝RNAlater保存液的凍存管中，封口編號備用。

1.3實驗步驟 按傳統(tǒng)一步法提取組織樣本中的總RNA，以12%瓊脂糖凝膠電泳抽樣檢驗其質(zhì)量。提取出RNA后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參基因?？偡磻?yīng)體系20 μL，其中探針（20 mmol/L）0.5 μL，引物（20 mmol/L）0.9 μL，Mix10 μL（PCR試劑盒，日本TOYOBO公司），標(biāo)本組織cDNA2 μL，H20補(bǔ)至20 μL，每個樣品的目的基因與內(nèi)參基因各設(shè)3個重復(fù)實驗。XAGE-1b與GAPDH分別在相應(yīng)的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR檢測。每次反應(yīng)均設(shè)置空白對照組及用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的6個梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)混合物，標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)混合物由復(fù)旦大學(xué)病毒與分子免疫學(xué)實驗室制備提供。PCR反應(yīng)結(jié)束后，計算機(jī)自動獲取標(biāo)本中XAGE-1b和GAPDH的Ct值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣本XAGE-1b和GAPDH基因的拷貝數(shù)。結(jié)果以XAGE-1b和GAPDH基因拷貝數(shù)的比值表示相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用χ2檢驗或秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

抽提RNA檢驗結(jié)果見圖1，在16s sRNA和28s sRNA條帶明亮、清晰，證明所得樣品質(zhì)量優(yōu)良。自64例肝癌組織和癌旁組織抽提的RNA經(jīng)PCR檢測，結(jié)果顯示肝癌組織表達(dá)量為2015×105，高于癌旁組織的表達(dá)量147×105，兩組比較存在顯著性差異（P<0.05）。XAGE-1b基因表達(dá)與患者的年齡、性別無相關(guān)性（P>0.05），見表1。

3討論

肝癌屬于在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，對人民的身心健康危害嚴(yán)重。由于肝癌早期的癥狀并不確切，而癥狀明顯時已發(fā)展為中晚期肝癌，因而臨床醫(yī)師們針對肝癌的早期診斷展開長期的實驗研究。肝癌患者確診后可以通過外科手術(shù)或者化療等手段進(jìn)行治療，目前已取得一定的成績，但值得一提的是很多肝癌患者會出現(xiàn)癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，為了改善肝癌患者的預(yù)后也應(yīng)及早診斷和發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。自20世紀(jì)以來分子生物學(xué)技術(shù)得到長足的發(fā)展，加上人類基因組計劃的支持，使得臨床工作者得以通過對肝癌細(xì)胞記憶的分析來探索更加靈敏和準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)記物，達(dá)到早期診斷的目的， 借助于腫瘤標(biāo)志物的檢測結(jié)果可以進(jìn)行針對性化療，降低非必要的化療引起的毒副作用。

到目前為止臨床中應(yīng)用過多種腫瘤標(biāo)志物如CEA、AFP、AFU等來診斷PHC，這些標(biāo)志物各有其優(yōu)勢和不足，國內(nèi)外專家近年來對XAGE-1b基因進(jìn)行了深入研究，并且獲得了XAGE-1b在腫瘤中較為詳細(xì)的表達(dá)譜[1]。經(jīng)證實XAGE-1b基因在肺癌、前列腺癌的癌組織中表達(dá)率較高，并且與腫瘤亞型和分期有一定的關(guān)聯(lián)，郭成等研究了四類XAGE-1異構(gòu)體在肝癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示XAGE-1b基因在肝癌組織中大量表達(dá)。目前由于缺少大樣本的實驗和長期隨訪，關(guān)于XAGE-1b在PHC中表達(dá)的研究仍處于小范圍和小樣本的初期階段，其檢測結(jié)果的局限性在所難免，而且XAGE-1b能夠區(qū)分腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞，良性與惡性腫瘤，但是難以區(qū)分具體的組織來源或病理類型的腫瘤，因此建議與AFP等腫瘤標(biāo)志物檢測相結(jié)合，通過綜合分析進(jìn)行研究，對于提高肝癌的確診率有積極的促進(jìn)作用[2]。

RT-PCR方法具有檢測時間短（<3 h），特異性和敏感性高的特點，可以從復(fù)雜的樣品中檢測出微量的目標(biāo)核酸，目前證實可用于淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體的定量測定[3]。定量PCR的應(yīng)用可了解微轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的數(shù)量，通過數(shù)量的變化可以觀察輔助治療的療效，從而為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據(jù)，鑒于以上優(yōu)點，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床診斷。缺點是存在假陽性風(fēng)險，操作過程中需要注意的是嚴(yán)格的無菌環(huán)境和防止mRNA的降解[4]。本研究證實了XAGE-1基因在肝癌的診斷中能夠較好地反映腫瘤細(xì)胞的播散程度，敏感性和特異性良好，為治療方法的選擇和療效的評價提供依據(jù)，改變肝癌篩選的傳統(tǒng)方法，顯著改善肝癌的及早發(fā)現(xiàn)和診斷，提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳濤，李中文，鮑明升.XAGE-1b基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)[J].求醫(yī)問藥（下半月），2013，（06）.

[2]朱江，江福能，戴奇山，等.肝癌細(xì)胞中XAGE-1b的表達(dá)和意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，（20）.

[3]JI Y，ZHANG W，WANG J，et al.mRNA expression of the XAGE-1b gene in human acute leukemia[J].Int J Hematol，2010，91（2）：209-212.

[4]Tureci O，Sahin U，Vollmar E，et al.Human carbonic anhydrase XII：cDNA cloning，expression，and chromosomal localization of a carbonic anhydrase gene that is overexpressed in some renal cell cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America[C]. 1998.編輯/張燕