醫(yī)用納米銀材料的遺傳毒理學(xué)研究

摘要：隨著納米科技的迅速發(fā)展和納米材料的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)各種納米材料和納米顆粒的接觸與暴露機(jī)會(huì)也日益增加。納米銀作為應(yīng)用最為廣泛的納米材料，其產(chǎn)品的生物安全性如何尚無(wú)定論。本文就近年國(guó)內(nèi)外最新的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)納米銀體內(nèi)外遺傳毒性以及其可能的機(jī)制作一介紹。

關(guān)鍵詞：納米銀；評(píng)價(jià)方法；遺傳毒性；毒性機(jī)制

納米銀是 21 世紀(jì)新型的抗菌劑研究開(kāi)發(fā)最為廣泛的一種。納米銀材料包括單純納米級(jí)的銀（Ag）單質(zhì)顆粒組成的材料，以及銀離子（Ag+）附載于納米級(jí)的載體上而成的材料。因其具有獨(dú)特的抗菌性能，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品、化妝品等領(lǐng)域。在我國(guó)國(guó)產(chǎn)的納米生物材料類(lèi)醫(yī)療器械的注冊(cè)記錄中，2002～2006年間，按照類(lèi)醫(yī)療器械曾得到批準(zhǔn)注冊(cè)的標(biāo)稱(chēng)含納米銀的抗菌系列產(chǎn)品約占56%，有近百件之多。美國(guó)FDA也以a類(lèi)醫(yī)療器械（510K批號(hào)）批準(zhǔn)了一部分含銀的敷料類(lèi)產(chǎn)品及其他納米技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，如骨填充修復(fù)材料，支架導(dǎo)管類(lèi)的納米涂層產(chǎn)品等[1]。

隨著人們對(duì)納米銀的需求日益增加，而納米銀工業(yè)或家用產(chǎn)品對(duì)人類(lèi)、動(dòng)物、植物的負(fù)面生物學(xué)效應(yīng)尚不完全清楚。有研究提示納米銀粒子在細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子生物學(xué)水平如基因和蛋白水平等具有一定毒性效應(yīng)。而目前絕大多數(shù)納米銀毒性的研究以細(xì)胞培養(yǎng)和急性毒性研究為主，對(duì)于納米銀作用于動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞系的遺傳毒性的研究資料相對(duì)較少，本文主要對(duì)納米銀的遺傳毒理學(xué)研究現(xiàn)狀做一綜述。

1納米銀遺傳毒性的評(píng)價(jià)方法

研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的納米銀具有一定潛在的遺傳毒性，傳統(tǒng)的檢測(cè)遺傳毒性的方法是否適用于檢測(cè)納米銀還沒(méi)有定論，而納米銀遺傳毒性的相關(guān)報(bào)道也非常有限。現(xiàn)有的評(píng)價(jià)遺傳毒性的方法主要有沙門(mén)氏菌致突變?cè)囼?yàn)（Ame's test）、微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)。有分析顯示體外的微核試驗(yàn)和艾姆斯氏實(shí)驗(yàn)可以完成嚙齒類(lèi)動(dòng)物的致癌物和活體遺傳毒的評(píng) 價(jià)[2]。

艾姆斯氏試驗(yàn)通常為評(píng)價(jià)化學(xué)遺傳毒性的首選。研究表明直徑為5 nm的納米銀在艾姆斯氏試驗(yàn)中呈陰性或弱陽(yáng)性，陰性結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于納米材料無(wú)法滲透入細(xì)胞壁，不可溶的粒子通過(guò)吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)菌的細(xì)胞壁無(wú)法完成此項(xiàng)功能致使納米銀粒子無(wú)法進(jìn)入細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)部損傷DNA或引發(fā)突變，而艾姆斯氏試驗(yàn)顯示弱陽(yáng)性可能是由于粒子的可溶性[3]。另外納米銀粒子的聚集可使粒子體積過(guò)大從而無(wú)法通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁的孔徑。納米粒子艾姆斯氏試驗(yàn)陰性還可能因?yàn)闇y(cè)試的菌株對(duì)氧化DNA損傷不敏感。艾姆斯氏試驗(yàn)中另一混雜因素就是試驗(yàn)樣品的抗菌性，納米銀正是由于這一抗菌性才被廣泛的應(yīng)用于各種產(chǎn)品，納米銀固有的毒性可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的敏感性降低。因此混雜了物理性質(zhì)、一般毒性和遺傳毒性的納米銀粒子可能會(huì)導(dǎo)致艾姆斯氏試驗(yàn)的假陽(yáng)性從而低估其致突變的能力。因此艾姆斯氏實(shí)驗(yàn)并不適用于評(píng)價(jià)納米粒子的遺傳毒性。

相比之下，體外的彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)比細(xì)菌中的艾姆斯氏試驗(yàn)更為敏感，研究表明彗星試驗(yàn)和細(xì)胞分裂阻滯微核試驗(yàn)證明納米銀可以導(dǎo)致DNA損傷，表現(xiàn)為線(xiàn)粒體功能下降，氧化應(yīng)激產(chǎn)生，細(xì)胞周期中斷等。彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)顯示納米銀引起的DNA損傷有劑量依賴(lài)性，研究表明納米粒子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的彗星試驗(yàn)呈陽(yáng)性，但在艾姆斯氏試驗(yàn)中呈陰性[4]。在微核試驗(yàn)中，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)納米銀是純金屬粒子不容易被S9混合物（大鼠肝勻漿）代謝，而S9混合物會(huì)形成膠團(tuán)或覆蓋納米銀粒子而可能影響納米銀的微核試驗(yàn)結(jié)果。有報(bào)道比對(duì)了S9混合物加入與否對(duì)微核試驗(yàn)和微核阻滯試驗(yàn)的結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)S9混合物對(duì)兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果并無(wú)影響[5]。

由此我們認(rèn)為在艾姆斯氏試驗(yàn)中納米銀不能引起突變，而在彗星實(shí)驗(yàn)和微核試驗(yàn)中納米銀的遺傳毒性呈劑量依賴(lài)性，提示在體外實(shí)驗(yàn)中彗星實(shí)驗(yàn)和微核試驗(yàn)比艾姆斯氏試驗(yàn)更適用于評(píng)價(jià)納米銀的遺傳毒性。而隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，在研究納米銀的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)中更應(yīng)該注重粒子的不同性質(zhì)如尺寸、形狀和攝取機(jī)制等。

2納米銀的體外遺傳毒性

許多體外試驗(yàn)從各個(gè)不同角度，通過(guò)多種體外遺傳毒性實(shí)驗(yàn)方法（如Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、染色體畸變分析以及彗星試驗(yàn)等），提示一定劑量的納米銀對(duì)多種動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞均有潛在遺傳毒性，包括小鼠胚胎干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、小鼠生殖干細(xì)胞、BRL3A大鼠肝細(xì)胞、大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、幼地鼠腎細(xì)、虹鱒魚(yú)肝細(xì)胞、日本青鳉纖維母細(xì)胞、人肺成纖維細(xì)胞和人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞、人皮膚癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞株等[6]。

AshaRani等應(yīng)用正常的人肺成纖維細(xì)胞（IMR-90）和人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞（U251），對(duì)淀粉涂覆的銀納米顆粒（6～20 nm）的毒性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，彗星試驗(yàn)中400 μg/ml納米銀作用IMR-90和U251兩種細(xì)胞后DNA尾部明顯延長(zhǎng)（18和6μm vs空白組3和1 μm），且呈劑量依賴(lài)性；胞質(zhì)分裂阻斷微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)200 μg/ml納米銀作用IMR-90和U251兩細(xì)胞后微核形成率明顯增加（14%和8%vs空白組3%和1%）。另外還發(fā)現(xiàn)納米銀劑量依賴(lài)性的損傷細(xì)胞線(xiàn)粒體并且增加活性氧簇的生成。TEM分析發(fā)現(xiàn)在線(xiàn)粒體和細(xì)胞核內(nèi)納米銀顆粒聚集，暗示其可能直接參與線(xiàn)粒體毒性和DNA損傷。推斷其產(chǎn)生毒性的一種可能機(jī)制是納米銀引起線(xiàn)粒體損傷，引起線(xiàn)粒體呼吸鏈斷裂，導(dǎo)致ROS的生成增加和ATP合成中止，最終導(dǎo)致DNA損傷[7]。Hackenberg等在利用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究也提示了納米銀對(duì)DNA的損傷作用，在彗星試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.1 μg/ml納米銀（100 nm）作用1 h即引起細(xì)胞DNA損傷，作用24 h后損傷明顯增強(qiáng)，同時(shí)還觀察到染色體異常[8]。

在納米銀對(duì)其他動(dòng)物細(xì)胞的研究中，Ahamed等報(bào)道了納米銀引起鼠胚胎成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白質(zhì)p53上調(diào)、DNA損傷修復(fù)蛋白R(shí)ad 51和DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)增加[9]。

這些體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明納米銀誘導(dǎo)多種動(dòng)物細(xì)胞的活性氧生成和炎癥反應(yīng)，直接或間接造成DNA損傷、細(xì)胞周期及有絲分裂遏止，導(dǎo)致染色體畸變，并呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，并且還發(fā)現(xiàn)其遺傳毒性強(qiáng)度與粒徑的大小、形狀、聚集狀態(tài)、顆粒表面的化學(xué)修飾及電荷有著重要的關(guān)聯(lián)性。提示納米銀具有一定的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。

3納米銀的體內(nèi)試驗(yàn)遺傳毒性

體外遺傳毒性試驗(yàn)作為評(píng)價(jià)物質(zhì)是否有遺傳毒性的初步方法，其特點(diǎn)是敏感性高，但是特異性低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，需要體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)進(jìn)一步明確其遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)程度。

目前對(duì)于納米銀的遺傳毒性研究主要集中于體外研究，對(duì)于體內(nèi)特別是哺乳動(dòng)物的遺傳毒性作用研究極少。Song等報(bào)道了雌性IRC小鼠單次腹腔注射納米銀（100 nm）48 h后，外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞微核率升高，DNA鏈ROS損傷產(chǎn)物8-oxodG在尿中含量升高，而在骨髓和肝臟中未檢測(cè)到明顯變化，作者認(rèn)為納米銀具其遺傳毒性并與氧化應(yīng)激有關(guān)[10]。而Kovvuru等研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠連續(xù)5 d經(jīng)口給予30 nm納米銀500 mg/kg后，外周血和骨髓中微核發(fā)生率升高，γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加以及外周血的8-oxoG水平升高，并且發(fā)現(xiàn)納米銀能夠影響DNA修復(fù)有關(guān)基因的表達(dá)，特別是明顯抑制了堿基切除修復(fù)基因的表達(dá)；同時(shí)對(duì)妊娠期C57BL/6J小鼠連續(xù)5 d經(jīng)口給予納米銀后，發(fā)現(xiàn)其胚胎在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)大片段DNA缺失。作者認(rèn)為口服納米銀能夠引起基因組不可逆的改變[11]。

對(duì)于非哺乳動(dòng)物模型的研究，如斑馬魚(yú)、虹鱒魚(yú)、貝類(lèi)、底棲動(dòng)物、果蠅等，也發(fā)現(xiàn)納米銀對(duì)其有遺傳毒性。在成年斑馬魚(yú)上發(fā)現(xiàn)納米銀能引起DNA損傷，γ-H2AX和p53表達(dá)增加[12]；少年虹鱒魚(yú)暴露于納米銀后引起脂質(zhì)過(guò)氧化（LOP），DNA鏈出現(xiàn)斷裂[13]。

然而對(duì)于納米銀的遺傳毒性研究也有不同的結(jié)論，如Kim等在SD大鼠的納米銀毒性研究試驗(yàn)中，連續(xù)經(jīng)口暴露28 d后未觀察到嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率增加[14]；Kim等也報(bào)道了在SD大鼠連續(xù)吸入納米銀90 d后，與對(duì)照組相比同樣未觀察到嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率增加[15]。

對(duì)于在體內(nèi)遺傳毒性評(píng)價(jià)中得到完全相反的兩種結(jié)論，我們認(rèn)為可能是主要是由于納米銀到達(dá)靶器官的濃度和作用時(shí)間不同引起的。由于納米銀經(jīng)消化道或呼吸道吸收進(jìn)入體內(nèi)后，主要分布在局部組織（胃和肺） 、肝臟、腎臟、脾臟等，存在于血液及骨髓的量非常少，滯留時(shí)間短[1]。因此，對(duì)于納米銀體內(nèi)遺傳毒性的評(píng)價(jià)，應(yīng)該增加敏感靶器官，進(jìn)行更全面的科學(xué)評(píng)價(jià)。

4納米銀遺傳毒性的可能機(jī)制

目前，對(duì)于納米銀遺傳毒性的機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為納米銀可能通過(guò)兩條途徑導(dǎo)致DNA損傷：①納米銀顆粒能夠直接通過(guò)亞細(xì)胞膜，經(jīng)核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并沉積，②通過(guò)TEM可以觀察到納米銀在人肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)沉積[14]，這些沉積的納米銀能夠與DNA和核蛋白結(jié)合，從而直接導(dǎo)致DNA鏈斷裂以及基因組重組。

另外，線(xiàn)粒體作為納米銀的毒性作用的敏感靶部位，納米銀進(jìn)入細(xì)胞后，結(jié)合NAD（P）H氧化酶產(chǎn)生氧化自由基，引起線(xiàn)粒體線(xiàn)粒體功能障礙，ROS產(chǎn)生以及促凋亡蛋白從線(xiàn)粒體中釋放，從而引起DNA損傷和染色體畸變。通過(guò)TEM觀察發(fā)現(xiàn)納米銀聚集在線(xiàn)粒體外，干擾線(xiàn)粒體依賴(lài)的jun-N激酶（JNK）途徑，引起人皮膚成纖維細(xì)胞、A549線(xiàn)粒體損傷，引起線(xiàn)粒體膜電位下降，膜通透性改變，導(dǎo)致氧化磷酸化系統(tǒng)解偶聯(lián)，引發(fā)線(xiàn)粒體呼吸鏈斷裂使活性氧生成增加，ATP耗竭，最終導(dǎo)致DNA損傷[16]。

此外，還有一些研究報(bào)道了納米銀能夠下調(diào)DNA的修復(fù)功能，特別是BER基因。BER基因在DNA氧化損傷修復(fù)中起重要作用，例如其中的Neil1、Neil3、Nthl1和Myh基因能夠切除氧化或錯(cuò)配的DNA堿基，產(chǎn)生AP位點(diǎn)[17]，Myh基因缺陷的C57BL/6J小鼠對(duì)納米銀的敏感性更高，更易發(fā)生DNA損傷。

4結(jié)論

綜上，基于現(xiàn)有的研究，納米銀的遺傳毒性及其機(jī)制尚不完全清楚，還需不斷的深入研究。納米銀在健康保健、疾病治療中的應(yīng)用方興未艾，還處于不斷的探索階段，隨著納米銀的廣泛應(yīng)用，研究者在尋找納米銀最佳的應(yīng)用劑量的同時(shí)亟需一個(gè)完善的納米銀毒性檢方案和相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，不但能保護(hù)人類(lèi)生命健康和環(huán)境完整性，也為納米銀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展注入源源不斷的動(dòng)力。

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