大孔樹脂純化楓蓼腸胃康總黃酮工藝

摘要：目的 優(yōu)化楓蓼腸胃康總黃酮大孔樹脂富集工藝。方法 以靜態(tài)和動態(tài)吸附率及解吸率為指標，從D-101，AB-8，HPD-300，NAK，XAD這5種大孔樹脂中篩選出最佳類型；并以總黃酮轉移率為指標，優(yōu)化上樣濃度、上樣液pH值、洗脫液濃度、洗脫速度。結果 AB-8型大孔樹脂最適宜楓蓼腸胃康總黃酮的純化，最佳工藝為：上樣濃度為3.4075 g/L，上樣液pH值調節(jié)為5.0，用50%乙醇以2 BV/h流速進行洗脫。結論 選用AB-8型大孔樹脂，以上述工藝能使楓蓼腸胃康總黃酮分離純化達到良好效果。

關鍵詞：楓蓼腸胃康；總黃酮；大孔樹脂

Optimization of Purification Process for Total Flavonoids From Fengliao Changweikang by Macroporous Resin

KE Wei，ZHONG Zhu-pei，LI Qing-guo

（School of Traditional Chinese Materia Medica，Traditional Chinese Medicine University of Guangzhou，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：Objective To optimize the enrichment of total flavonoids from Fengliao Changweikang by macroporous resin.Methods To screen the best type of macroporous resin from D-101，AB-8，HPD-300，NAK and XAD by taking static and dynamic absorption and desorption ratio as indexes；and to optimize sample concentration，sample pH，eluent concentration，elution velocity by taking the total transfer rate of total flavonoids as index.Results AB-8 macroporous resin is the most suitable type for purification of total flavonoids from Fengliao Changweikang and the optimum condition is as follows：sample concentration 5 g·L-1，sample pH5.0，eluant concentration 50 % ethanol，elution velocity 2 BV/h.Conclusion Good separation and purification results can be achieved by above-mentioned techniques by using AB-8 macroporous resin.

Key words：Fengliao Changweikang；Total flavonoids；Macroporous resin

楓蓼腸胃康為國家中藥保護品種（保護品種號ZYB2072004057）。該復方由辣蓼和牛耳楓以質量比1∶2組成。功能理氣健胃，除濕化滯，臨床上主要用于治療急慢性胃腸炎，腹瀉等消化系統(tǒng)疾病，且沒有明顯的不良反應及毒副作用[1]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，組成該復方的兩味中藥辣蓼、牛耳楓均主含黃酮類成分[2-3]，復方中黃酮類化合物的研究也有報告[1]，但目前尚無該復方總黃酮的純化工藝研究。而越來越多的研究表明黃酮類化合物是該復方的有效成分[4-6]。

1儀器與試藥

756MC紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），EL204-IC電子天平 （METTLER TOLEDO公司），RE-2000型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），恒溫振蕩器（金壇市富華電器有限公司），KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，D-101，AB-8，HPD-300，NAK，XAD型大孔樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司），蘆丁（批號為100080-200707，中國藥品生物制品檢定所）。辣蓼，牛耳楓藥材（購于廣州清平中藥材市場），其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1楓蓼腸胃康總黃酮含量測定 精密稱取12.5 mg蘆丁對照品，用50%乙醇超聲溶解，定容至50 mL，得質量濃度為0.25 g/L蘆丁標準品溶液。分別吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，

6.0 ml于25 ml量瓶中，再加入5%NaNO2溶液1 ml，搖勻并靜置5 min，加入10%AI（NO3）3溶液1 ml，搖勻并靜置5min；再加4%NaOH溶液10 ml，最后用50%乙醇定容至刻度，搖勻。放置15 min后，利用紫外-可見吸收光譜儀在510 nm處測定吸光度。，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.0136X-0.0014（r=0.9999）。結果蘆丁在0.010～0.060 g/L呈良好的線性關系。

2.2楓蓼腸胃康總黃酮的提取 稱取辣蓼300 g，牛耳楓600 g，蒸餾水浸泡1 h，水煎煮法提取2次，第1次煎煮1.5 h，過濾，濾液待用。第2次煎煮1 h，過濾，留取濾液。合并2次濾液，濾液用旋轉蒸發(fā)器以80℃減壓濃縮，然后利用真空干燥箱干燥，得浸膏。上樣之前稱取5g浸膏，超聲溶解，定容至25 ml，得樣品母液。過濾，取2 ml濾液以50%乙醇定容至10 ml，在此10 ml中取0.5 ml按2.1項下測量楓蓼腸胃康總黃酮，得總黃酮質量濃度為13.63 g/L。此外，再移取5 ml樣品母液，以50%乙醇稀釋定容至20 ml量瓶中，即得濃度為3.4075 g/L的樣品儲備液，作為后續(xù)工藝篩選的備用樣品。

2.3大孔樹脂的預處理 將大孔樹脂置于燒杯中，加入95%乙醇浸泡24 h，并不時攪拌，濕法裝柱，依次用90%，70%，50%，30%，15%乙醇洗脫，直至洗脫液與水按1∶5混合不呈現(xiàn)渾濁現(xiàn)象為止。最后用蒸餾水沖洗至洗脫液無醇味。然后用5%鹽酸浸泡4 h，水洗至中性為止；再用5%氫氧化鈉浸泡4 h，水洗至中性，備用。

2.4不同型號大孔樹脂的篩選

2.4.1靜態(tài)吸附與解吸性能的考察 取經(jīng)預處理的五種大孔樹脂，抽干水分，各稱取2 g，轉移至100 ml錐形瓶中，加入2.2項下樣品儲備液20 ml，密封，置于恒溫振蕩器中，以100 r/min連續(xù)震蕩12 h，使充分吸附，過濾，按照2.1條測定吸光度，從而計算各種樹脂靜態(tài)吸附量、解吸量及解吸率，見表1。其中：比吸附量=（起初濃度-殘余濃度）×溶液體積/干樹脂質量；比解吸量=（解吸液濃度×解吸液體積））/干樹脂質量；解吸率（%）=比解吸量/比吸附量×100%。

結果表明，靜態(tài)吸附與解吸性能較好的大孔樹脂為D-101，AB-8和XAD，因此再利用動態(tài)解吸與吸附性能進一步優(yōu)選。

2.4.2動態(tài)吸附與解吸性能的考察 取處理好的D-101，AB-8，XAD大孔樹脂各20 g，填裝入同一規(guī)格的層析柱（2 cm×30 cm）內，加入2.2項下樣品儲備液5 ml。靜置12 h使充分吸附至吸附達到飽和。收集吸附之后的樣液，按2.1項下方法操作，測定剩余黃酮含量。同理用50%乙醇進行充分的洗脫，至洗出液檢測不出黃酮為止，收集洗脫液，以旋轉蒸發(fā)器濃縮，并以50%乙醇定容至20 ml，按2.1項下方法操作，計算總黃酮含量，然后依次計算各參數(shù)值，結果表明，D-101，AB-8，XAD動態(tài)解吸率分別為83.6%，89.4%，76.2%。因此AB-8型大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸性能優(yōu)于D-101和XAD。

綜合2.4.1與2.4.2兩項結果可知，AB-8型大孔樹脂無論是在靜態(tài)還是動態(tài)狀態(tài)下，其吸附與解吸性能均表現(xiàn)優(yōu)良，因此本實驗選取AB-8型大孔樹脂作為吸附劑。

2.5 AB-8型大孔樹脂純化楓蓼腸胃康總黃酮的工藝考察

2.5.1上樣濃度的考察 取2.2項下樣品母液，稀釋得不同的濃度樣品各5 ml，上樣之后，先用蒸餾水沖洗，再用50%乙醇洗脫至洗出液檢測不出黃酮為止。將洗脫液合并，濃縮定容至20 ml。而后按照2.1項下操作，測定洗脫液總黃酮含量，考察不同上樣濃度的總黃酮轉移率。（總黃酮轉移率=洗脫后所得總黃酮質量/上樣液中總黃酮質量）實驗表明，當上樣濃度分別為1.1358，2.2716，3.4075，4.5433，5.6729 g/L時，總黃酮轉移率分別為91.3%，84.5%，82.1%，75.3%，71.5%。因此可知，上樣濃度越低，總黃酮轉移率越大。但上樣濃度達到4.5433 g/L時，總黃酮轉移率明顯下降?？紤]到實際操作時，對于相同量的樣品，上樣濃度過小，則所需分離次數(shù)會增加。因此本實驗選取上樣濃度3.4075 g/L。

2.5.2上樣液pH值的考察 取2.2項下樣品儲備液5 ml，調節(jié)至不同pH值，上樣之后，先用蒸餾水洗脫。而后用50%乙醇洗脫。收集洗脫液，濃縮定容至20 ml。按2.1項操作，測量吸光度并計算對應的總黃酮轉移率，結果顯示，上樣液pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0時，總黃酮轉移率分別為77.2%，81.3%，88.1%，82.9%。可見pH為5.0時，總黃酮轉移率最大，因此將最佳上樣pH值確定為5.0。

2.5.3洗脫劑濃度的考察 取2.2項下樣品儲備液5 ml，上樣之后，先用蒸餾水洗脫。再用不同濃度梯度的乙醇溶液進行洗脫，每個濃度梯度使用2BV的洗脫液。所用乙醇濃度分別為15%，30%，50%，70%，90%。分別將各濃度梯度洗脫液濃縮定容至20 ml。而后按照2.1項方法測定吸光度，計算各濃度梯度下總黃酮的濃度，見表2。

由表2可知，30%濃度梯度下洗脫出的總黃酮最多，約占洗脫出的總黃酮的50%。50%乙醇已經(jīng)將大部分黃酮洗脫出。因此確定50%乙醇為最佳洗脫濃度。

2.5.4洗脫液流速的考察 取2.2項下樣品儲備液5 ml，平行準備5份樣品。于相同實驗環(huán)境下，用50%乙醇以不同的洗脫速度進行洗脫，以考察各流速下總黃酮轉移率。當洗脫流速分別為1，2，3，4 BV/h時，總黃酮轉移率分別為92.8%，84.5%，80.1%，76.5%。由此可知，洗脫速度較慢時，總黃酮轉移較完全。但考慮實際生產時，洗脫過慢，必定耗費大量的時間，故而確定最佳洗脫速度為2 BV/h。

綜上所述，大孔樹脂純化楓蓼腸胃康總黃酮的最佳工藝為：選用AB-8型大孔樹脂，上樣濃度為3.4075 g/L，上樣液pH值調節(jié)為5.0，用50%乙醇以2 BV/h流速進行洗脫。

3討論

3.1聚酰胺色譜法是黃酮類化合物的經(jīng)典純化方法。對各種黃酮類化合物有較好的分離，且其容量比較大，適合于制備性分離[7]。故筆者首先考察了聚酰胺色譜法分離純化總黃酮的工藝條件，但實驗發(fā)現(xiàn)聚酰胺樹脂對總黃酮的吸附性過強，導致總黃酮轉移率較低（總黃酮轉移率<60%），因此舍棄利用聚酰胺柱色譜法對楓蓼腸胃康總黃酮純化工藝進行考察。而后再繼續(xù)考察大孔樹脂色譜法的工藝條件。

3.2大孔樹脂最大優(yōu)點在于可以回收再生，但多次使用后可能會導致吸附性下降而影響其性能。由于本實驗考察工藝時樣品量小，屬于小批量實驗，故大孔樹脂在多次使用后性能未見明顯變化。而且層析床徑高比對分離仍有較大影響，因此建議本工藝在用于實際大生產時，仍需進一步優(yōu)化條件以適應實際分離純化的需要。

參考文獻：

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編輯/肖慧