狂犬病口服疫苗研究進展

摘要：狂犬病是一種重要人畜共患病。防制狂犬病的最佳方法是疫苗免疫，而口服是免疫的最佳途徑?，F(xiàn)口服疫苗的研制取得了許多成果，本文就狂犬病口服狂犬疫苗的研究進展進行了綜述。

關鍵詞：狂犬?。豢诜?；疫苗

狂犬病（Rabies）是有狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一種危害人類健康的最古老的疾病?？袢×餍袕V，病毒可感染幾乎所有溫血動物，是一種危害嚴重的人獸共患病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，每年至少有50萬人進行暴露后疫苗免疫，每年世界范圍內(nèi)病毒感染導致全球有大約5.5萬人死于狂犬病，其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國家。該病死亡率100%，目前尚未能有效控制。狂犬病是一種可以用疫苗進行預防的疾病，犬是本病主要傳染源，在拉美通過免疫犬使得人和犬狂犬病感染率得到了顯著下降，因此通過對犬進行免疫的方法可以更好的控制狂犬病。調(diào)查表明，我國犬免疫率不足，無法形成免疫屏障，口服疫苗的方式不同于傳統(tǒng)注射的免疫方式，更為方便，便于擴大免疫覆蓋率，是簡便有效的方式。本文就狂犬病口服疫苗的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 狂犬病病毒疫苗毒株的研究現(xiàn)狀

1962年美國科學家首次將狂犬病弱毒疫苗通過胃管導入狐貍的胃中，沒有免疫成功，美國CDC于1970年狂犬病弱毒疫苗對狐貍進行口服免疫試驗，并比較了CVS、LEP、HEP、ERA株的免疫效果，試驗一年后在實驗室獲得成功，結(jié)果表明ERA株具有最好的口服免疫原性，為以后口服疫苗的開發(fā)打下了基礎。

ERA株源于SAD株，SAD株經(jīng)瑞士科學家在BHK-21細胞上適應后變?yōu)镾AD Bern株和SADswiss株；德國科學家通過BHK21細胞克隆研制出SAD突變株SAD B19。然而，SADBem株和SAD B19株對成年野生嚙齒動物、犬和部分野生動物有一定毒力，所以科學家又用單克隆抗體對SAD株進行克隆，選育出SAG1株，該毒株為雙缺失株，即病毒糖蛋白的第Ⅲ位點和第Ⅱ位點發(fā)生突變，失去了對幼犬及六種成年嚙齒類動物的毒力。

SAG2株是由SADBem株選育而來的。SADB19、SAD Bern和SAG2是目前歐洲用作口服疫苗的毒株。而在美國和加拿大則主要是使用重組牛痘病毒和重組人腺病毒表達的狂犬病毒ERA株糖蛋白，即V-RG和ONRAB。

另外還有CTN-1株，CTN-1株是中國科學家用狂犬病街毒經(jīng)鼠腦傳代后成為固定毒，又經(jīng)二倍體細胞傳代得到的二倍體適應株CTN-1株，用該株制備口服疫苗一次免疫可提高長達15個月的保護力。

2 狂犬病口服疫苗的研究現(xiàn)狀在得到合適的毒株后，人們開始尋找簡單方便的免疫方式，口服無疑是最佳的選擇。于是學者們不斷嘗試研制狂犬病口服疫苗，到目前為止取得了許多的成果。

鄭海發(fā)等將CTN-1株經(jīng)Vero細胞傳15代后給犬口服，30d陽轉(zhuǎn)率為l00%，又用10倍劑量給犬口服，取犬腦和唾液在BHK21細胞盲傳2代，同時小鼠腦內(nèi)盲傳，進行病毒分離，均為陰性，結(jié)果表明該口服疫苗具有較好的安全性和口服免疫原性。

另外，為了延長疫苗對動物機體的刺激時間，緩釋材料也被嘗試用在疫苗的研制過程中。孫加燕以狂犬病病毒雞胚低代毒（Flury-Iep）為模型，海藻酸鈉為緩釋材料制備緩釋微丸，研制Flury株的口服疫苗，并進行了口服疫苗的安全性、有效性和無菌性研究。結(jié)果表明該狂犬病口服疫苗，收到了良好的免疫效果，這就為動物口服疫苗的研究提供了一個新的研究方向。

狂犬病病毒為人獸共患病病毒，不僅要考慮免疫動物的安全性還要考慮對人和環(huán)境的安全性，因此狂犬病病毒弱毒則成為活疫苗的最佳選擇。Darkaoui S等利用SAG2株制備了口服疫苗，根據(jù)WHO推薦的方法分別對農(nóng)村犬、流浪犬和野生犬進行了口服疫苗的免疫，結(jié)果顯示三種方式分別有77%、46.7%和73%的誘餌被采食。這表明誘餌對犬有良好的適口性，口服疫苗的方式是可行的。

眾所周知，疫苗的保護率是評價一個疫苗的重要指標，所以在提高保護率方面學者們也做了很大努力。Yang DK等通過反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建了一株重組病毒（ERAG3G株），通過口服免疫小鼠研究其效果，并通過肌肉注射免疫貓來觀察其安全性。結(jié)果全部小鼠均產(chǎn)生對狂犬病毒重組病毒的保護力，貓免疫后28d中和抗體效價高達2.62～23.9IU/mL，為口服重組疫苗的研制提供了參考。說明構(gòu)建的重組病毒可以為動物提供較好的保護。

要達到免疫的作用，主要是要機體產(chǎn)生針對該病毒的中和抗體，而中和抗體的產(chǎn)生并非一定要全病毒的存在，只要能刺激機體產(chǎn)生中和抗體的抗原存在即可，因此可以利用分子生物學的手段得到這些抗原，從而避免使用全病毒，這樣安全性便可得到保障。現(xiàn)代分子生物技術的發(fā)展為疫苗的研制提供了強有力的工具，使得人們可以按照意愿在病毒基因水平進行改造，從而在狂犬病疫苗的研發(fā)中起到了重大的作用。Rupprecht CE等試驗了重組狂犬病毒經(jīng)口服免疫犬后的安全性、免疫原性和效果，并與商品化的以牛痘病毒為載體表達狂犬病毒糖蛋白的重組疫苗效果進行了對比，結(jié)果表明，首免后1-2周多數(shù)動物都產(chǎn)生了狂犬病毒中和抗體，之后用街毒進行攻毒，對照組全部發(fā)病，免疫組均未發(fā)病，疫苗對照組有一只發(fā)病，顯示出該疫苗良好的安全性和效果。Zhang S等制備了以犬腺病毒2型為載體表達狂犬病病毒糖蛋白的重組病毒疫苗的誘餌，并在犬進行試驗。用該重組疫苗滴鼻免疫46只犬，口服免疫90只犬。結(jié)果表明87.5%的免疫犬產(chǎn)生中和抗體，免疫后2～3周可以檢測到免疫反應，5～6周達到高峰90.8%的犬中和抗體持續(xù)超過24個月，抗體滴度維持在0.5IU/mL以上。免疫后2年用60 000只小鼠半數(shù)致死量的CVS-24進行10只犬的攻毒試驗，犬均存活，顯示出重組疫苗口服良好的效果。

由以上可以看出目前口服疫苗的研究多為病毒活載體疫苗及基于反向遺傳技術的弱毒活疫苗，而郭恒則利用減毒沙門氏菌為運載體，構(gòu)建了口服狂犬病疫苗。該研究為狂犬口服疫苗的研制提供了一種成本更加低廉的備選方案。

雖然國內(nèi)目前在狂犬病口服疫苗方面做了很多的研究，但是尚未有產(chǎn)品上市銷售，國際上也僅有兩種產(chǎn)品，分別為ONRAB@和V-RG@。Mainguy J等比較了ONRAB@和V-RG@兩種口服疫苗的野外投撒效果，抗體產(chǎn)生率結(jié)果數(shù)據(jù)顯示ONRAB@疫苗比V-RG@具有更好的免疫效果。

研制出的口服疫苗需要通過上市銷售來被使用，企業(yè)也需要盈利，這樣制作口服疫苗的成本也必須成為考慮因素之一，因此尋找更為廉價的生產(chǎn)方式是必然要求，特別對于發(fā)展中國家，這種疫苗更有推廣價值。植物為重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的廉價系統(tǒng)，增加了生產(chǎn)進程。在植物組織中表達的狂犬抗原在肌內(nèi)和口服免疫后的小鼠身上具有免疫原性和保護性。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物是表達外源抗原更為有效的方法之一，為了生產(chǎn)植物源性的狂犬抗原，用煙草的病原相關蛋白基因替代狂犬糖蛋白基因中的信號肽。無論是口服還是肌內(nèi)注射在小鼠身上植物源性抗原都可以誘導強烈的黏膜和體液免疫反應。雖然植物源性的抗原具有很多優(yōu)點，但是在植物源性的狂犬疫苗應用到家畜之前還有一些問題需要解決，其中最重要的就是需要提高在未成熟轉(zhuǎn)基因植物中的表達，并且減少不同系和后代中蛋白表達水平的主體性變異。另外，還有必要縮短從不同植物中獲取蛋白的時間。另外，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表達水平還相當?shù)?，如果表達水平方面的技術難題一旦攻破，將為生產(chǎn)安全廉價有效的新型狂犬病口服疫苗提供空前繁榮的前景。

3 展望

犬是狂犬病的主要宿主，動物狂犬病是人狂犬病的根源，已經(jīng)造成了人類死亡病例的將近99%。消滅動物狂犬病關鍵要加強對動物的免疫接種，雖然我國狂犬病疫苗經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)研制成功安全有效且純化濃縮的組織細胞狂犬病疫苗，疫苗質(zhì)量已接近或達到國際先進水平，但其中還存在接種價格昂貴，接種不方便的原因。另外近幾年來高新技術在狂犬病疫苗研究廣泛應用，以生物反應器培養(yǎng)狂犬病病毒，制備狂犬病的口服疫苗，不僅成本更為低廉，在接種方式上也更為方便，便于大規(guī)模的使用，無論是寵物、農(nóng)村犬還是流浪犬和野生犬，都可以用口服疫苗進行免疫，這樣在動物會形成更高的免疫覆蓋率，形成免疫屏障，使得狂犬病的發(fā)病率和病毒的攜帶率極大降低，為動物和人類的生命健康做出重要貢獻。

在狂犬病口服疫苗的研制方面，筆者認為除了疫苗可以刺激機體產(chǎn)生高效抗體外，還需要對疫苗保存進行研究?？诜呙绲膽貌粌H限于寵物犬和農(nóng)村犬，對于流浪犬和野生犬也同樣適用，這樣疫苗投撒到外部環(huán)境后必須在一定的時間、溫度和濕度內(nèi)保持疫苗的免疫效力，否則動物采食后也起不到免疫的效果。因此在疫苗的保護劑方面還需要進行進一步研究。

緩釋技術對疫苗的免疫效果同樣具有重要的影響，延長免疫原在動物體內(nèi)的存留時間便可延長疫苗對動物的保護期，因此提高緩釋材料對病毒的包埋率，以及減小包埋后對抗原活性的影響是研究重點。

口服的方式是最為方便直接的免疫方式，狂犬病口服疫苗無疑將會成為未來狂犬病疫苗研發(fā)的方向。