新型稀釋液TCM199和甘油對(duì)牛精液凍存效果研究

摘要：通過(guò)對(duì)以TCM199為主要稀釋劑，以甘油（GL）為冷凍保護(hù)劑的牛細(xì)管凍精的活力測(cè)定，篩選出了以TCM199、GL為稀釋劑和冷凍保護(hù)劑的新型牛細(xì)管凍精制作配方。測(cè)定表明，以TCM199為主要稀釋劑、GL為冷凍保護(hù)劑時(shí)，配方11的活力最高，達(dá)到0.60。

關(guān)鍵詞：TCM199；甘油；細(xì)管凍精；活力

1 試驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

近年來(lái)的研究表明，在細(xì)胞、胚胎冷凍過(guò)程中，為了克服低溫對(duì)胚胎等微小生命的打擊，減少或消除細(xì)胞和組織間冰晶的形成，必須在培養(yǎng)液中添加一定量的抗凍劑。以前使用的主要是二甲基亞砜（DMSO）或甘油（GL），但是他們均對(duì)細(xì)胞或胚胎產(chǎn)生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL強(qiáng)，所以現(xiàn)多用GL。本試驗(yàn)將利用TCM199作為能量和營(yíng)養(yǎng)素來(lái)源，以GL作為冷凍保護(hù)劑，多梯度研究TCM199、GL作為稀釋劑和冷凍保護(hù)劑保護(hù)精子的最優(yōu)劑量，建立新型牛精液稀釋和冷凍保存技術(shù)。

2 試驗(yàn)設(shè)備和要求

種公牛來(lái)自寧縣興旺牧業(yè)種牛場(chǎng)和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所牛場(chǎng)。主要設(shè)備有人工采精器械、專用保溫箱、吸管、冰箱、冷凍儀等。

3 試驗(yàn)方法和步驟

稀釋液：按照設(shè)計(jì)配方、用量進(jìn)行配制。

冷凍液：第一液為低濃度冷凍液，用于牛精液采集后的第一次稀釋；第二液為高濃度冷凍液，用于第二次平衡稀釋。

TCM199按照其說(shuō)明濃度配制，并用酚紅和NaOH進(jìn)行pH標(biāo)定。GL按照設(shè)計(jì)添加。

本試驗(yàn)針對(duì)以下3種處理實(shí)施，即測(cè)定不含冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果、添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑的精子凍存效果、以TCM199和GL為冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果。每個(gè)水平測(cè)定10次（重復(fù)），每次制作100枚細(xì)管凍精，從中隨即抽檢10枚，每次抽檢測(cè)定均在制凍后24h進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果用spss統(tǒng)計(jì)分析。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 不含冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果

4.1.1 配方組合本試驗(yàn)系列配方中設(shè)計(jì)缺失TCM199、乙二醇（EG）和GL，僅僅用常規(guī)能量、抗生素構(gòu)成稀釋液，并進(jìn)行冷凍保存和解凍觀測(cè)。目的是評(píng)定和掌握牛精液的保存和抗冷凍打擊的特性，為下一步試驗(yàn)提供參考數(shù)據(jù)。各組合配方詳見(jiàn)表I。

本系列配方中用卵磷脂替代卵黃，添加tris以圖進(jìn)一步提高稀釋液的緩沖能力，給精子提供良好的生存環(huán)境。

4.1.2 不合冷凍保護(hù)劑的細(xì)管凍精解凍效果按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)定的時(shí)間，對(duì)凍存24h后的試驗(yàn)凍精進(jìn)行解凍。解凍時(shí)先準(zhǔn)備好30℃水浴，將細(xì)管凍精在水浴中攪動(dòng)2～3s解凍，用細(xì)管剪剪掉細(xì)管兩端封口，分別在安排時(shí)段提取該管解凍精液抹片觀察和記錄，觀察溫度為25℃。

每組配方測(cè)定10枚細(xì)管凍精。解凍效果統(tǒng)計(jì)詳見(jiàn)表2。

測(cè)定結(jié)果表明：

1）在不添加冷凍保護(hù)劑和稀釋劑，但添加果糖等基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)素的情況下，用超純水稀釋冷凍的牛精液也保持了適度的解凍活力。效果最好的為8號(hào)配方，在18h時(shí)的活力仍然維持在0.3的水平。

2）在不添加其它成分，僅僅用超純水稀釋的情況下，解凍凍精也有較高的活力，并且維持了較長(zhǎng)時(shí)間。如10號(hào)配方，剛解凍后的活力有0.45，只是有效活力維持時(shí)間短。

3）活力衰減速率不一致。圖1是表2資料的圖示效果，各組在0～6h期間的活力下降最快，6～30h期間活力緩慢下降，30～48h期間的活力平穩(wěn)下降。

4.2 添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑的細(xì)管凍精解凍效果

本項(xiàng)試驗(yàn)中，稀釋液僅僅添加了不同劑量的TCM199，未添加GL和EG，以便更好地掌握TCM199在牛精液冷凍保存過(guò)程中的效果。各組配方和效果測(cè)定分述如下。

4.2.1 配方組合添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑組的配方詳見(jiàn)表3。在測(cè)定不同濃度TCM199的同時(shí)，在平行配方中還添加了Tris、檸檬酸鈉、卵磷脂等。其中1、2、3、4、7號(hào)添加了Tris，5、6、8號(hào)添加了檸檬酸鈉，9號(hào)添加了卵磷脂。

4.2.2 細(xì)管凍精解凍效果添加TCM199但不含冷凍保護(hù)劑組的解凍效果詳見(jiàn)表4。

測(cè)定結(jié)果表明：

1）在只添加TCM199而未添加冷凍保護(hù)劑的情況下，冷凍解凍精液也保持了一定的活力。效果最好的為1號(hào)和5號(hào)配方，在18h時(shí)的活力仍然維持在0.2～0.3的水平。其它各組合在剛解凍時(shí)活力還較高，但持續(xù)時(shí)間短，活力下降速度快。

2）活力下降高峰期出現(xiàn)在0～6h階段。各組下降速度基本一致，在圖2中顯示出相似的斜率。在6～24h階段，各組合活力的下降速度趨緩，但在24～30h階段又出現(xiàn)了活力迅速下降的現(xiàn)象，此后精子開(kāi)始顯著衰竭、殘缺和死亡，失去了受精能力。

4.3 以TCM199和GL為稀釋劑和冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果

4.3.1 配方組合

表5中2項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)不添加TCM199、GL、EG以及不添加GL或EG的稀釋液、冷凍液對(duì)牛精液的冷凍保存和解凍活力進(jìn)行了探討，初步掌握了在這2種情況下牛精液的保存情況，從本項(xiàng)試驗(yàn)開(kāi)始，將在此基礎(chǔ)上，對(duì)添加冷凍劑的情況進(jìn)行深入研究。本項(xiàng)將測(cè)定以TCM199和GL為冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果。其系列配方詳見(jiàn)表5。特點(diǎn)是TCM199梯度增加，GL適度變化，5號(hào)配方增加了安鈉加。

測(cè)定結(jié)果表明：

1）不同濃度TCM199+GL組的凍精解凍活力不同。0～12h活力11、2、3號(hào)組高于其它組（p<0.01），同時(shí)，1、4、10號(hào)也表現(xiàn)出了較高的活力。

2）活力衰減速率不一致。如圖2所示?；盍λp比較緩慢的是1、2、3、4、11號(hào)，減緩比較快的是5、6、7、8、9、10號(hào)。從配方構(gòu)成看，衰減緩慢的組中TCM199和GL的比例低，衰減快的含量高且添加了檸檬酸鈉。11號(hào)中TCM199和GL的比例雖然高，但卻表現(xiàn)出了本專題試驗(yàn)中最好的曲線，這與缺失果糖和檸檬酸鈉有關(guān)。

3）綜合比較。TCM199本身就是一種復(fù)合型營(yíng)養(yǎng)體，含有細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的多種營(yíng)養(yǎng)成分。添加過(guò)多的其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)反而未得到更高的活力表達(dá)，如無(wú)其它營(yíng)養(yǎng)素的11號(hào)最好，添加了檸檬酸鈉和果糖的最差，未添加檸檬酸鈉的較好，這在圖3中給予了直觀反映。

5 結(jié)果與分析

通過(guò)本次對(duì)TCM199、GL組及其對(duì)比試驗(yàn)表明：

1）未添加試驗(yàn)成分的牛精液的冷凍解凍效果。本試驗(yàn)的基礎(chǔ)液為果糖和超純水，部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷凍精液解凍后也表現(xiàn)出了一定的活力，特別是剛解凍后的活力比較高，但在解凍后活力迅速下降，畸形精子迅速增多，可判斷為該類精子的受精能力低下，不能用于生產(chǎn)性配種繁育。同時(shí)也說(shuō)明牛精液自身具備良好的抗低溫打擊能力。

2）以TCM199為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗(yàn)是在基礎(chǔ)液果糖和超純水的基礎(chǔ)上，加入了TCM199，同時(shí)也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷凍精液解凍后的表現(xiàn)與未添加TCM199和GL的組相似，也表現(xiàn)出了一定的活力，特別是剛解凍后的活力比較高，但在解凍后活力迅速下降，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，畸形精子不斷增多。效果最好的為l號(hào)和5號(hào)配方，在18h時(shí)的活力仍然維持在0.2～0.3的水平。

3）以TCM199+GL為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗(yàn)是在基礎(chǔ)液果糖和超純水的基礎(chǔ)上，加入了TCM199和GL，同時(shí)也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂。其冷凍精液解凍活力明顯高于未添加TCM199和GL的組和僅添加TCM199的組。測(cè)定表明，不同濃度TCM199+GL組的凍精解凍活力不同?；盍Ω咔冶容^穩(wěn)定的是11、2、3號(hào)組

4）綜合分析。通過(guò)對(duì)3種不同處理及其多樣本資源的測(cè)定與分析，表明牛精液的處理方法不同，其凍精解凍活力不同?？瞻滋幚砗蛢H添加TCM199的處理測(cè)定說(shuō)明了精子本身具有良好的抗低溫打擊能力，解凍活力較好，但維持時(shí)間很短，活力喪失速度快，精子品種不佳，不具備受精能力。TCM199+GL組解凍凍精的質(zhì)量較高，其解凍精子的活力維持時(shí)間較長(zhǎng)，精子品質(zhì)較高。推薦配方為TCM199+GL組的配方11。