離子色譜—電導檢測法測定豆奶粉中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量

摘 要：該文建立了豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定方法。豆奶粉樣品經乙酸低溫沉淀和固相萃取凈化，采用離子色譜-電導檢測分析，并考察了線性、檢出限、準確性、精密度和加標回收率等。結果表明，亞硝酸鹽（以NO2-計）和硝酸鹽（以NO3-計）分別在0.01～0.20μg/mL和0.10～2.00μg/mL的范圍內線性良好，相關系數(shù)（r）均大于0.99，在豆奶粉中的檢出限分別為0.04/0.016mg/kg（NO2-/NO3-）；加標回收率分別為94.3%/97.1%（NO2-/NO3-）；方法的準確性分別為91.0%/96.5%（NO2-/NO3-），精密度分別為2.7%/1.4%（NO2-/NO3-）。對市售4種豆奶粉樣品進行篩查，亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量均小于國家限量標準。本方法簡便快速、靈敏度高、準確性、重復性好，可用于豆奶粉質量控制中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定。

關鍵詞：豆奶粉；亞硝酸鹽；硝酸鹽；離子色譜

中圖分類號 TS252 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）22-110-04

Abstract：Arapid and sensitive method was developed for the analysis of nitrite and nitrate in soybean milk powder.Soybean milk powder sample was sequence cleaned by low temperature-acetic acid precipitation and sold phase extraction，and then analyzed by ion chromatography-conductivity detector.The methodology was validated with linearity，limit of detection，accuracy，precision andrecovery.The results showed that both nitrite and nitrate had good linearrelationships over therange of 0.01～0.20μg/mL （NO2-） and 0.10～2.00μg/mL （NO3-） with correlation coefficients （r） greater than 0.99.Limits of detection in soybean milk powder were 0.04/0.016mg/kg （NO2-/NO3-）.Recoveries were 94.3% for NO2- and 97.1% for NO3-.Accuracies and precisions of the method were 91.0%/96.5% （NO2-/NO3-） and 2.7%/1.4% （NO2-/NO3-）.The method was applied to 4 different commercial soybean milk powder samples，all were under the maximum requirements of national standard for nitrite and nitrate.The method shows good accuracy andrepeatable，and can be used to monitor nitrite and nitrate in soybean milk power for quality control.

Key words：Soybean milk powder； Nitrite； Nitrate； Ion chromatography

亞硝酸鹽可以與體內蛋白質分解產生胺形成亞硝胺，同時亞硝酸鹽也可以使血液中的Fe2+氧化為Fe3+，從而使正常的血紅蛋白轉變?yōu)楦哞F血紅蛋白而失去攜氧能力，引起高鐵血紅蛋白癥，嚴重時可致死；硝酸鹽在體內可通過腸道微生物及唾液等的作用轉變?yōu)閬喯跛猁}[1-2]。據(jù)報道，1999-2008年我國由亞硝酸鹽引起的食物中毒有237起案例，其中死亡35人[3]。豆奶粉是以大豆和乳制品為主要原料，經磨漿、加熱滅酶、濃縮、噴霧干燥而制成的粉狀或微粒食品，富含多種營養(yǎng)成分，深受國內老百姓喜愛。在豆奶粉的生產、加工、儲藏、運輸及使用過程中，容易變質產生微量的亞硝酸鹽和硝酸鹽。因此，監(jiān)測豆奶粉中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，對豆奶粉的技術質量標準的建立和產品質量安全評價具有非常重要的意義。

食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測方法有分光光度法（如國標GB 5009.33-2010中的第二法和第三法）和離子色譜法（如國標GB 5009.33-2010中的第一法）等。在分光光度法中，亞硝酸鹽采用對氨基苯磺酸+鹽酸萘乙二胺法測定，或磺胺+N-1-萘基-乙二胺二鹽酸鹽法測定；硝酸鹽采用鎘柱還原成亞硝酸鹽，測得亞硝酸鹽總量，由此總量減去亞硝酸鹽含量，即得試樣中硝酸鹽含量。鎘柱還原法操作復雜繁瑣，重現(xiàn)性差，不適宜大批量樣品的檢測；同時，鎘對實驗操作人員具有潛在的危害，對環(huán)境也容易造成污染。而離子色譜法樣品前處理簡便、快速，專屬性好，已用于多種食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定[4-8]。本文在國標第一法“離子色譜法”的基礎上進行了改進，旨在簡化樣品前處理過程，優(yōu)化色譜分離條件，通過方法學考察，對市售豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量進行篩查，為豆奶粉的質量安全提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 （1）儀器：ICS-2100型離子色譜系統(tǒng)，配ASRS型抑制器及電導檢測器（美國DIONEX公司）；SQP型精密電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；2-16KL型冷凍離心機（美國SIGMA公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國MILLIPOR公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；電子連續(xù)等分移液器（德國BRAND公司）。（2）試劑：乙酸（分析純）購自Sigma-Aldrich公司；C18固相萃取柱購自美國Waters公司；水中亞硝酸根離子溶液有證標準物質（1 000μg/mL，U=2%，k=2）和水中硝酸根離子溶液有證標準物質（1 000μg/mL，U=1%，k=2）由浙江省計量科學研究院提供；豆奶粉樣品購自當?shù)爻小?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作溶液的配制 準確吸取適量亞硝酸根和硝酸根離子溶液有證標準物質，用超純水稀釋，配成濃度分別為1.00/10.0μg/mL（NO2-/NO3-）的混合中間溶液；再用超純水系列稀釋該中間溶液，配成濃度分別為0.01/0.10、0.02/0.20、0.04/0.40、0.06/0.60、0.08/0.80、0.10/1.00、0.15/1.50、0.20/2.00μg/mL（NO2-/NO3-）的混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取豆奶粉樣品1.25g（精確至0.01g），置于50mL 離心管中，加超純水40mL，搖勻，超聲30min，加入3%乙酸水溶液1mL，于4℃放置20min，取出放置至室溫，再加超純水10mL，搖勻，并于9 400r/min離心15min。取適量上清液過C18固相萃取柱（使用前依次用甲醇、超純水活化），棄去前面5mL，收集后面洗脫液待測。

1.2.3 色譜條件 陰離子色譜分析柱為DIONEX IonPac AS19 （4×250mM），保護柱為DIONEX IonPac AG19 （4×50mM）；柱溫為30℃；電導檢測池溫度為35℃；抑制器電流為180mA；進樣體積為50μL；淋洗液為氫氧化鉀溶液；流速為1.3mL/min；梯度洗脫，5mmol/L保持33 min，1min上升至50mmol，50mmol/L保持5min，1min降至5mmol，5mmol/L保持5min。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 豆奶粉中含有大量的蛋白質，樣品前處理參考國標GB 5009.33-2010第一法“離子色譜法”中乳粉的提取方法，采用乙酸低溫沉淀蛋白的方法。實驗中也改進了國標方法中樣品提取的一些步驟，如采用離心管沉淀蛋白，并使用電子連續(xù)等分移液器準確添加水及乙酸溶液，避免了容量瓶定容等繁瑣的操作；同時，采用離心管，蛋白沉淀后補足水，可以直接離心，避免了使用濾紙過濾等步驟。改進的方法簡單、快速，可以進行批量操作，效率高，批次重復性好。豆奶粉基質復雜，除含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、礦物質以外，還添加了多種食品添加劑，采用固相萃取的方法可以有效去除脂肪、維生素、植物油等C18柱有保留的組分。在國標GB 5009.33-2010方法中，還需依次通過Ag柱和Na柱，以去除氯離子和鈉離子的干擾。在本實驗中，氯離子和亞硝酸根離子具有良好的分離度，如圖1所示。因此，無需再通過Ag柱和Na柱進一步凈化。

2.2 離子色譜分離條件的優(yōu)化 在豆奶粉樣品的前處理過程中，使用乙酸低溫沉淀蛋白的方法，離心后上清液非常清澈，微量的沉淀及懸浮顆?？梢酝ㄟ^固相萃取進一步去除，說明乙酸低溫沉淀蛋白的方法效率較高。但是，該方法在樣品溶液中引入了乙酸，乙酸對離子色譜的分離有一定的影響，如圖1中保留時間6～8min的色譜峰。在離子色譜分離中需要優(yōu)化洗脫條件，避免乙酸、氯離子及干擾雜質的影響。實驗比較了不同濃度氫氧化鉀洗脫的情況，采用高濃度的氫氧化鉀，亞硝酸根和硝酸根離子洗脫較快，但與雜質的分離度較差，如采用20mM氫氧化鉀，亞硝酸根離子與氯離子后面的雜質不能實現(xiàn)基線分離，同時乙酸及氯離子峰拖尾對亞硝酸根離子的定量造成影響。實驗采用5mM氫氧化鉀洗脫，如圖1所示，亞硝酸根和硝酸根離子均與雜質實現(xiàn)基線分離，濃度較大的乙酸及氯離子對亞硝酸根離子也沒有影響。

2.3 線性及方法檢出限 如1.2節(jié)所述，配制不同濃度的亞硝酸根和硝酸根離子混合標準工作溶液，在優(yōu)化的色譜條件下進行測定，以亞硝酸根或硝酸根離子的濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積（μS*min）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性擬合，如圖2所示。對亞硝酸根和硝酸根離子，其回歸方程分別為Y=0.2635X-0.0007和Y=0.3132X-0.0117，相關系數(shù)（r）分別為0.999 39和0.999 78。可以看出，對亞硝酸根離子，在0.01～0.20μg/mL的范圍內線性關系良好，對硝酸根離子，在0.10～2.00μg/mL的范圍內線性關系良好。以標準曲線的最低點為定量下線，對應豆奶粉的最低定量限為0.40/4.00mg/kg（NO2-/NO3-）。以3倍信噪比計算方法的檢出限，亞硝酸根和硝酸根離子的檢出限分別為0.001μg/mL和0.0004μg/mL，對應豆奶粉的檢出限分別為0.04mg/kg和0.016mg/kg。

2.4 方法的準確性和精密度 由于缺乏豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽成分分析的基體標準物質，以及由于標準工作溶液和豆奶粉樣品基質溶液的差異，不能直接測定方法的準確性。本實驗中采用方法空白溶液加標的方法，測定方法的準確性和精密度（相對標準偏差，RSD）。具體方法為：準確吸取49mL超純水，加入1mL3%乙酸水溶液，混勻，作為方法空白溶液；添加適量亞硝酸根離子和硝酸根離子的標準溶液，配制成濃度分別為0.10/1.00μg/mL的空白基質加標樣品，平行制備6份進行測定。對亞硝酸根離子，方法的準確性和精密度分別為91.0%和2.7%，對亞硝酸根離子，方法的準確性和精密度分別為96.5%和1.4%。

2.5 加標回收率 準確稱取豆奶粉樣品1.25g，按低、中、高3個濃度水平加入適量的亞硝酸根和硝酸根離子標準溶液，按1.2.2節(jié)進行樣品的前處理（對加標回收率考察的樣品，對第一次加入超純水的體積適當調整，使得添加亞硝酸根和硝酸根離子標準溶液的體積與超純水的體積總量為40mL），豆奶粉本底測定樣品及添加3種不同濃度水平考察回收率的樣品各平行制備3份，按實驗方法進行測定，結果如表1所示。由表1可以看出，添加3種不同濃度水平的亞硝酸根離子和硝酸根離子，平均加標回收率分別為94.3%和97.1%。

2.6 豆奶粉樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定 按照1.2節(jié)實驗方法，測定市售的2種品牌4種豆奶粉中亞硝酸根和硝酸根離子的含量，結果見表2。從表2可以看出，所測試的4種豆奶粉中亞硝酸根的含量均小于0.50mg/kg，硝酸根離子的含量均小于7.00mg/kg。呂岱竹[9]采用離子色譜法測定了市售3種不同品牌的豆奶粉樣品，其中亞硝酸鹽（以NO2-計）和硝酸鹽（以NO3-計）的含量分別為13.21～13.69mg/kg和127.3～129.5mg/kg，均高于本文測試的結果，可能是其方法中標準曲線的濃度太高，其中亞硝酸根離子的線性范圍為1～25mg/mL，硝酸根離子的線性范圍為1～100mg/mL，均高于本文標準濃度的數(shù)十倍。我國國家標準《速溶豆粉和豆奶粉》（GB/T 18738-2006）的相關技術指標中并沒有規(guī)定污染物亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量限值；在國家標準《食品中污染物的限量》（GB2762-2012）中也沒有明確規(guī)定豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽的限量。如果按照“乳粉”中亞硝酸鹽的限量計算（以NaNO2計，限值為2.00mg/kg；或以NO2-計，限值為1.30mg/kg），以及“嬰幼兒谷類輔助食品”中硝酸鹽的含量計算（以NaNO3計，限值為100mg/kg；或以NO3-計，限值為73.0mg/kg），上述測定的4種豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量均小于限量標準。

3 結論

本文建立了豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量測定的方法，通過優(yōu)化樣品前處理條件和離子色譜分離條件，實現(xiàn)了亞硝酸根和硝酸根離子與雜質的基線分離，對線性、檢出限、準確性、精密度和加標回收率等進行了方法學考察，并用于實際樣品的分析測定。結果表明，該方法具有樣品前處理簡單快速、檢出限低、準確性高、重復性好等特點，可用于豆奶粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定，對豆奶粉的質量控制和安全評價具有重大的意義。

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