綠香椿組織培養(yǎng)外植體褐變現(xiàn)象的研究

摘 要：以綠香椿頂芽為外植體，對(duì)其組織培養(yǎng)過(guò)程褐化的發(fā)生及預(yù)防進(jìn)行研究，結(jié)果表明：不同消毒劑處理的頂芽褐化率不同，其中褐化率最低的是0.1%HgCl2；在培養(yǎng)基中分別添加活性炭（AC）、抗壞血酸（VC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）3中防褐化劑，效果最好的是1g/L聚乙烯吡咯烷酮。

關(guān)鍵詞：香椿；組織培養(yǎng)；褐變

中圖分類(lèi)號(hào) S644.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）22-37-02

香椿（Toona sinensis）別名紅香椿、香椿頭、椿甜樹(shù)、香椿芽、椿陽(yáng)樹(shù)、香椿樹(shù)等，香椿屬，多年生木本植物。香椿的食用價(jià)值、藥用價(jià)值表現(xiàn)突出，而隨著香椿芽食藥用價(jià)值研究的深入[1]，作為我國(guó)唯一木本蔬菜，市場(chǎng)上興起了一股香椿熱潮，大棚、溫室等保護(hù)地設(shè)施也被廣泛利用，香椿芽周年栽培技術(shù)逐漸成熟，并且將此技術(shù)逐漸推廣開(kāi)來(lái)[2-3]。由于常規(guī)的種子繁殖、扦插育苗、分蘗繁殖等存在諸多問(wèn)題，難以滿足市場(chǎng)對(duì)香椿種苗的大規(guī)模需求，因此，植物組織培養(yǎng)已成為一種重要的繁殖途徑，但香椿初代培養(yǎng)過(guò)程存在較嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了優(yōu)質(zhì)香椿種苗的快速生產(chǎn)。筆者選擇本地大棚栽培的綠香椿頂芽為外植體，研究綠香椿組織培養(yǎng)過(guò)程中防褐化最佳條件，為香椿工廠化生產(chǎn)種苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 香椿頂芽來(lái)自于河南省農(nóng)科院在河南省高新科技園區(qū)的香椿苗圃，苗齡3a的綠香椿。

1.2 材料處理與消毒 香椿頂芽于4月中旬采集。材料采回后，先用流水沖洗30min，再用洗潔精水浸泡3min，并用軟毛刷輕輕刷洗表面，最后用流水沖洗干凈，在無(wú)菌條件下進(jìn)行消毒。將材料分成4份，先用75%的酒精浸泡30～60s，再分別用0.1%升汞（HgCl2）、2%次氯酸鈉（NaClO）、10%過(guò)氧化氫（H2O2）、1%硝酸銀（AgNO3）進(jìn)行消毒處理，最后用無(wú)菌水沖洗3～5遍。接種前用無(wú)菌吸水紙吸干材料表面的水分，將材料有切口的部位切除少許，剪成1.5～2cm的莖段，快速接種到培養(yǎng)基中。

1.3 不同添加物處理對(duì)外植體褐化的影響 外植體的處理同1.2，消毒劑選擇0.1%HgCl2處理10min。培養(yǎng)基中分別添加活性炭（AC）（160目[4]）、抗壞血酸（VC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），設(shè)計(jì)不同的試驗(yàn)處理，以不添加任何吸附劑和抗氧化劑的處理為對(duì)照。

1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 基本培養(yǎng)基均采用MS+6-BA O.5mg/L+GA3 1.0mg/L，加入蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，培養(yǎng)基pH5.8～6.0，培養(yǎng)基均添加20mg/L的四環(huán)素[5]。培養(yǎng)溫度為23～28℃，光照強(qiáng)度1 000～1 500lx，光照時(shí)間10h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑對(duì)外植體褐變的影響 綠香椿頂芽在經(jīng)過(guò)消毒處理后就出現(xiàn)部分芽莖顏色呈褐色，接種后3h即發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2處理的材料向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，10h后其他處理也出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，其中AgNO3褐變最輕，12d后褐變基本穩(wěn)定，結(jié)果（見(jiàn)表1）。10%H2O2處理的褐變率最高，達(dá)62.5%，且褐變最嚴(yán)重的。其次是2%NaClO，0.1%HgCl2和1%AgNO 3褐變率均較低。H2O2之所以嚴(yán)重，可能與其氧離子的氧化性有關(guān)，加速褐變的發(fā)生，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。從發(fā)芽率看，0.1%處HgCl2理的材料芽萌發(fā)率最高，達(dá)42.5%。其次是1%AgNO 3的37.5%，萌發(fā)率最低的是10%H2O2的17.5，由于褐變嚴(yán)重，導(dǎo)致了材料的死亡，造成萌發(fā)率低。因此，從芽萌發(fā)率考慮，選擇0.1%HgCl2處理10min效果更好。

2.2 不同添加物綠香椿外植體褐變的影響 本試驗(yàn)在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加具有抗褐化效果的活性炭、抗壞血酸和聚乙烯吡咯烷酮，3周后統(tǒng)計(jì)褐變率，4周后統(tǒng)計(jì)萌芽率（見(jiàn)表2）。試驗(yàn)結(jié)果表明，3種添加物與對(duì)照（CK）相比有明顯的抗褐化效果，效果最好的是聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸，褐化率只有15.0%，其次是活性炭20.0%。3種添加劑作用機(jī)理不同，活性炭是一種強(qiáng)吸附劑，對(duì)吸附對(duì)象沒(méi)有選擇性，酚類(lèi)物質(zhì)以及褐化產(chǎn)生的醌類(lèi)物質(zhì)都能被吸附；聚乙烯吡咯烷酮是酚類(lèi)物質(zhì)的專(zhuān)一吸附劑，常作為酚類(lèi)物質(zhì)和細(xì)胞的保護(hù)劑，對(duì)褐變有一定的防止作用，但受到酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)的影響[6]；抗壞血酸一方面使多酚氧化酶失活阻止酚類(lèi)物質(zhì)氧化，另一方面消耗掉溶解氧，使酚類(lèi)物質(zhì)因缺氧而無(wú)法氧化，對(duì)已形成的醌類(lèi)物質(zhì)則沒(méi)辦法破壞[7]。然而活性炭的強(qiáng)吸附作用降低了生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用效果，影響了外植體的發(fā)育，使萌芽率反而低于CK，而聚乙烯吡咯烷酮與抗壞血酸的褐變率相同，但萌芽率更高，可能前者對(duì)香椿芽萌發(fā)有促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

褐變主要是酚類(lèi)化合物在多酚氧化酶的催化下，被氧化成褐色的醌類(lèi)化合物，醌類(lèi)化合物在酪氨酸酶的作用下與植物組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，造成酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝停止，生長(zhǎng)受阻，最終使材料死亡[8]。由于褐變受酚類(lèi)物質(zhì)含量的影響，含量高的易發(fā)生褐變，植物體中酚類(lèi)物質(zhì)的含量又受到植物基因型、植株生長(zhǎng)環(huán)境光照強(qiáng)弱等因素的影響。

褐變?cè)谥参锝M織培養(yǎng)初代培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生，香椿褐變現(xiàn)象研究的人很少，馬勤[9]在對(duì)香椿腋芽、許麗瓊等[10]對(duì)香椿葉片葉柄組培快繁中都遇到了褐變的問(wèn)題，馬勤認(rèn)為取材之前先弱光培養(yǎng)一段時(shí)間可減輕褐變，出現(xiàn)褐化后可連續(xù)轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中，減輕毒害，許麗瓊認(rèn)為減輕褐變的方法是選則枝條中部的葉片和葉柄。本試驗(yàn)采用頂芽為外植體進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，消毒劑的類(lèi)型會(huì)影響到外植體的褐變程度，選擇具有氧化性的H2O2和NaClO褐變較嚴(yán)重，而非氧化性的AgNO3和HgCl2褐變較輕，且芽萌發(fā)率也高。在培養(yǎng)基中分別添加活性炭（AC）、抗壞血酸（VC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），試驗(yàn)結(jié)果表明3種添加劑對(duì)褐變都有明顯的減輕作用，其中1g/L的聚乙烯吡咯烷酮不僅能有效地防止褐變的發(fā)生，同時(shí)還能得到較高的芽萌發(fā)率。

參考文獻(xiàn)

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