細(xì)胞間直接接觸誘導(dǎo)BMSC軟骨分化的初步研究

劉 霞 周廣東 劉 偉 曹誼林

細(xì)胞間直接接觸誘導(dǎo)BMSC軟骨分化的初步研究

劉 霞 周廣東 劉 偉 曹誼林

目的探討細(xì)胞間直接接觸是否能夠單獨(dú)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSC）軟骨分化。方法體外培養(yǎng)擴(kuò)增豬BMSC與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將1.0×106的細(xì)胞總量以2 000 r/min離心8 min，制成細(xì)胞團(tuán)塊，即Pellet培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為5組，實(shí)驗(yàn)組：經(jīng)0.5%多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞與BMSC以1∶1混合；對(duì)照組1：同等數(shù)量的未經(jīng)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞與BMSC 1∶1共培養(yǎng)制成Pellet；對(duì)照組2：同等數(shù)量的單純軟骨細(xì)胞制成Pellet；對(duì)照組3：同等數(shù)量的單純BMSC制成Pellet；對(duì)照組4：同等數(shù)量的單純經(jīng)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞制成Pellet。每3天換液一次，每組3例。培養(yǎng)4周后，以大體觀察、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、RT-PCR等方法對(duì)Pellet進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。結(jié)果培養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組形成的Pellet，明顯縮小，形狀略不規(guī)則，顏色灰暗，柔軟且沒(méi)有彈性，組織學(xué)檢測(cè)提示主要為纖維性成分及死細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，Safranin O染色及Ⅱ型膠原免疫組化均為陰性，RT-PCR檢測(cè)未表達(dá)Ⅱ型膠原。對(duì)照組1和對(duì)照組2均形成圓盤(pán)狀組織塊，表面光滑，觸之有一定彈性，組織學(xué)檢測(cè)軟骨陷窩形態(tài)規(guī)則，Safranin O染色及Ⅱ型膠原免疫組化均有陽(yáng)性表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原高表達(dá)。對(duì)照組3的組織塊明顯收縮，呈褐色，無(wú)彈性。對(duì)照組4，細(xì)胞松散，不能形成Pellet。對(duì)照組3和4的各種軟骨特異性相關(guān)檢測(cè)均為陰性。結(jié)論細(xì)胞間直接接觸不能夠單獨(dú)誘導(dǎo)BMSC向軟骨分化，不是軟骨細(xì)胞與BMSC混合共培養(yǎng)中發(fā)揮誘導(dǎo)作用的主要因素。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞軟骨細(xì)胞細(xì)胞間直接接觸多聚甲醛軟骨形成

近年來(lái)，通過(guò)成體細(xì)胞與干細(xì)胞混合共培養(yǎng)誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化已成為干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)之一[1-3]。共培養(yǎng)方法不但是一種良好的誘導(dǎo)方法，而且深入研究共培養(yǎng)的誘導(dǎo)機(jī)制，可以為研究干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和組織微環(huán)境提供有意義的參考。共培養(yǎng)誘導(dǎo)機(jī)制可能包括：①細(xì)胞分泌的多種可溶性因子通過(guò)旁分泌作用誘導(dǎo)干細(xì)胞分化；②細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)形成特異的局部基質(zhì)環(huán)境，包繞干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化；③細(xì)胞間直接物理接觸，通過(guò)膜蛋白的直接接觸，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化。

我們?cè)谇捌谘芯恐?，通過(guò)細(xì)胞標(biāo)記已證實(shí)，軟骨細(xì)胞與BMSC混合共培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)其向軟骨分化[4]，并通過(guò)隔離共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和軟骨細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),首先驗(yàn)證了軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子能夠單獨(dú)誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化并形成軟骨組織，是軟骨細(xì)胞發(fā)揮誘導(dǎo)作用的主要因素之一。在這些實(shí)驗(yàn)中，雖然沒(méi)有細(xì)胞間的直接接觸，但仍然形成了軟骨組織。本實(shí)驗(yàn)中，我們將軟骨細(xì)胞經(jīng)0.5%多聚甲醛固定后與BMSC混合離心形成Pellet，研究軟骨細(xì)胞與BMSC單純物理接觸，能否誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康長(zhǎng)楓雜交豬6只（上海川沙養(yǎng)殖廠），雌雄不限，1～2月齡，體重6～8 kg。

1.2 豬BMSC的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增

于股骨近端抽取骨髓5～10 mL，注入含肝素的離心管中。參照全骨髓培養(yǎng)法[5]，離心洗滌2次，加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM（GIBCO公司，美國(guó)）培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以7.5×105cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)。3～5 d后首次換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)近80%融合后，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，以1×104cells/cm2的密度接種，進(jìn)行細(xì)胞傳代，優(yōu)選第2代細(xì)胞。

1.3 豬軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增

取豬膝關(guān)節(jié)軟骨，切成3 mm×3 mm×1 mm大小，以0.1%的Ⅱ型膠原酶消化8～12 h，過(guò)濾、離心、洗滌、計(jì)數(shù)。以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，按2.0×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)。48 h后首次換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)近融合后，以0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，收集備用。

1.4 固定軟骨細(xì)胞[2，6]

用PBS將4%多聚甲醛稀釋成0.5%，0.22 μm濾器過(guò)濾后，備用。收集第1代軟骨細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心8 min，形成細(xì)胞團(tuán)，棄去上清，加入無(wú)菌0.5%多聚甲醛20 mL，室溫下固定2 h，2 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS重懸，反復(fù)沖洗3次，制成細(xì)胞懸液備用。

1.5 軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)分為5組。實(shí)驗(yàn)組：經(jīng)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞與BMSC以1∶1混合，細(xì)胞總量為1.0×106個(gè)，2 000 r/min離心8 min制成細(xì)胞團(tuán)塊（即Pellet）培養(yǎng)；對(duì)照組1：同等數(shù)量的未經(jīng)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞與BMSC共培養(yǎng)制成Pellet；對(duì)照組2：同等數(shù)量的未經(jīng)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞制成Pellet；對(duì)照組3：同等數(shù)量的BMSC制成Pellet；對(duì)照組4：同等數(shù)量的單純經(jīng)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞制成Pellet。各組均每3天換液1次，每組3例，培養(yǎng)4周后檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)

1.6.1 碘化丙啶（PI）染色檢測(cè)多聚甲醛固定后的軟骨細(xì)胞

培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞爬片，取3張，經(jīng)0.5%多聚甲醛固定后，PI染色1 min，蒸餾水沖洗，熒光顯微鏡下觀察，未經(jīng)固定的細(xì)胞爬片作為對(duì)照。

1.6.2 大體觀察

觀察各組Pellet培養(yǎng)過(guò)程中的變化，以及培養(yǎng)4周后取材時(shí)的大小、形狀、質(zhì)地、色澤的變化，并觀察各組間的差別。

1.6.3 組織學(xué)檢測(cè)

將取出的組織以4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察培養(yǎng)物的組織結(jié)構(gòu)，包括組織的連續(xù)性、軟骨陷窩形成情況；Safranin O染色，檢測(cè)軟骨特異性基質(zhì)分泌情況；免疫組化檢測(cè)各組標(biāo)本Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。

1.6.4 RT-PCR檢測(cè)[7]

分別抽提上述各組組織的總mRNA，經(jīng)RTPCR方法檢測(cè)構(gòu)建組織中Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定后PI染色結(jié)果

PI不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能夠透過(guò)死細(xì)胞的細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅。軟骨細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定后，PI染色陽(yáng)性，說(shuō)明經(jīng)固定后細(xì)胞已死亡，而未經(jīng)固定的軟骨細(xì)胞PI染色陰性（圖1）。

2.2 大體觀察

4周后取材，實(shí)驗(yàn)組形成的組織塊明顯縮小，形狀略不規(guī)則，顏色灰暗，柔軟沒(méi)有彈性；對(duì)照組1和2均形成圓盤(pán)狀組織塊，表面光滑，觸之有一定彈性；對(duì)照組3的組織塊明顯收縮，組織呈褐色，無(wú)彈性；對(duì)照組4，細(xì)胞松散，不能形成小組織塊，因此無(wú)法取材作組織學(xué)檢測(cè)（圖2）。

2.3 HE染色

實(shí)驗(yàn)組的組織內(nèi)主要為纖維性成分，還可見(jiàn)死細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)；對(duì)照組1和2的組織內(nèi)，特別是周邊部位，有類(lèi)似軟骨樣組織形成，軟骨陷窩形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，陷窩內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)染的胞核；實(shí)驗(yàn)組3主要為纖維性成分（圖3）。

2.4 Safranin O染色

對(duì)照組1和2的組織內(nèi)分布著大量紅染的胞外基質(zhì)，含有大量空泡樣軟骨陷窩，表明細(xì)胞分泌大量GAG成分；而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組3染色為陰性（圖4）。

2.5 Ⅱ型膠原免疫組化

與基質(zhì)染色一致，對(duì)照組1和2的組織內(nèi)有大量棕黃色顆粒沉積，說(shuō)明組織內(nèi)有大量Ⅱ型膠原表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組3為陰性（圖5）。

2.6 RT-PCR

對(duì)照組1和2，均能表達(dá)成熟軟骨的特異性基因Ⅱ型膠原，提示形成了成熟軟骨樣組織；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組3，未見(jiàn)軟骨特異性基因表達(dá)，表明在經(jīng)過(guò)多聚甲醛固定的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)下，或單純BMSC不能自發(fā)形成軟骨樣組織；對(duì)照組4的β-actin幾乎沒(méi)有表達(dá)，說(shuō)明在培養(yǎng)過(guò)程中其RNA已基本降解（圖6）。

圖4 Safranin O染色（100×）

圖5 Ⅱ型膠原免疫組化染色（100×）

圖6 RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原基因的表達(dá)

3 討論

細(xì)胞間直接接觸，即細(xì)胞間接觸性依賴的通訊，不需要分泌的化學(xué)信號(hào)分子的釋放，代之以通過(guò)與質(zhì)膜結(jié)合的信號(hào)分子與其相接觸的靶細(xì)胞質(zhì)膜上的受體分子相結(jié)合，影響其他細(xì)胞。這種通訊方式在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)組織內(nèi)相鄰細(xì)胞的分化具有重要作用[8]。這類(lèi)信號(hào)分子與受體都是細(xì)胞的跨膜蛋白。每個(gè)細(xì)胞都有眾多的分子分布于膜的外表面，或?yàn)榈鞍踪|(zhì)，或?yàn)樘堑鞍住＿@些表面分子作為細(xì)胞的觸角，可以與相鄰細(xì)胞的膜表面分子特異性的相互識(shí)別和相互作用，以達(dá)到功能上的相互協(xié)調(diào)。

研究證實(shí)，在某些組織的共培養(yǎng)中，細(xì)胞間直接接觸發(fā)揮了重要作用。例如，在體外通過(guò)心肌細(xì)胞與BMSC共培養(yǎng)的方法模擬心肌內(nèi)環(huán)境，可以將BMSC誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，并證實(shí)直接的細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用是BMSC分化為心肌細(xì)胞所必需的[1，9]。Ball等[10]通過(guò)基質(zhì)干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)證實(shí)，與內(nèi)皮細(xì)胞的直接接觸是基質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的決定性因素。這些研究證明了膜相關(guān)信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞間直接接觸在細(xì)胞種系分化中的重要性。

我們將0.5%多聚甲醛固定后的軟骨細(xì)胞與BMSC共培養(yǎng)，觀察其軟骨形成情況。多聚甲醛可以固定細(xì)胞成分，防止細(xì)胞融合的發(fā)生，而且不會(huì)破壞受體介導(dǎo)的細(xì)胞識(shí)別和相互連接，即某些細(xì)胞表面分子，如多種跨膜蛋白能夠抵抗多聚甲醛的作用，固定后仍然能傳遞細(xì)胞間信號(hào)[2，11]。有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞與2%多聚甲醛固定的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以表達(dá)心肌細(xì)胞特殊標(biāo)志，如α-actin、desmin、myosin等，說(shuō)明經(jīng)多聚甲醛固定后，細(xì)胞膜蛋白仍能保持其活性[12]。因此，我們將多聚甲醛固定后的軟骨細(xì)胞與BMSC共培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞已不能分泌可溶性因子和細(xì)胞外基質(zhì)，但其細(xì)胞膜表面蛋白的作用仍然保留，這樣可以單獨(dú)研究細(xì)胞間直接物理接觸在誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化中的作用。

結(jié)果顯示，經(jīng)多聚甲醛處理后，軟骨細(xì)胞PI染色陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞已被固定，與BMSC混合共培養(yǎng)，形成的Pellet結(jié)構(gòu)較為松散，組織學(xué)和軟骨特異性基質(zhì)染色都沒(méi)有軟骨形成的跡象。單純經(jīng)多聚甲醛固定后的軟骨細(xì)胞由于沒(méi)有基質(zhì)的分泌，也不能形成Pellet，更不能表達(dá)軟骨特點(diǎn)。而對(duì)照組未經(jīng)多聚甲醛處理的軟骨細(xì)胞與BMSC混合共培養(yǎng)，形成了較成熟的軟骨組織。這些結(jié)果提示我們，單純的細(xì)胞間相互接觸基本無(wú)軟骨誘導(dǎo)作用，可能不是共培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞發(fā)揮軟骨誘導(dǎo)作用的主要因素。

每種組織有其結(jié)構(gòu)和功能的特殊性，不同組織需要的誘導(dǎo)環(huán)境是不一樣的。因此，細(xì)胞間直接接觸的誘導(dǎo)作用，對(duì)于不同組織也不能一概而論。例如，心肌組織作為功能性合胞體，心肌細(xì)胞的收縮是同步的，體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上則為心肌細(xì)胞間有閏盤(pán)結(jié)構(gòu)，該處細(xì)胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成橋粒，彼此緊密連接，有利于電信號(hào)、化學(xué)信號(hào)等的快速傳導(dǎo)。而且，心肌細(xì)胞收縮時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械牽拉也是誘導(dǎo)BMSC向心肌細(xì)胞分化的必要條件[9]。因此，心肌細(xì)胞與BMSC共培養(yǎng)，細(xì)胞間的直接接觸不但涉及了細(xì)胞膜蛋白的作用，更重要的是心肌細(xì)胞收縮時(shí)對(duì)BMSC的機(jī)械牽拉作用也在發(fā)揮重要的誘導(dǎo)作用。軟骨組織具有負(fù)重、潤(rùn)滑等功能，在正常軟骨組織中，軟骨細(xì)胞含量較少，主要是細(xì)胞外基質(zhì)，軟骨細(xì)胞被胞外基質(zhì)包裹，互相之間并沒(méi)有直接接觸。研究證實(shí)，對(duì)于軟骨細(xì)胞，細(xì)胞間的直接接觸雖然對(duì)于胚胎時(shí)期的軟骨分化有重要作用，但是軟骨細(xì)胞間的直接接觸也會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大[13]。因此，對(duì)于軟骨組織，細(xì)胞間直接接觸所發(fā)揮的作用可能相對(duì)較弱。

本研究中，經(jīng)多聚甲醛固定后的軟骨細(xì)胞已經(jīng)是死細(xì)胞，不能完全代表活體狀態(tài)下的情況，而且多聚甲醛也有可能會(huì)破壞某些細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，我們還需要對(duì)軟骨細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞間連接等進(jìn)行深入研究，以得到更為確切的結(jié)論。

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The Study on the Role of the Cell-cell Contact in Inducing Bone Marrow Stromal Cells Chondrogenesis

LIU Xia1, ZHOU Guangdong2,LIU Wei2,CAO Yilin1.
1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong.

ObjectiveTo explore the possibility of cell-cell contact in initiating chondrogenic differentiation of BMSCs. MethodsPorcine BMSCs and chondrocytes were respectively in vitro expanded.And then chondrocytes were inactivated by 0.5%paraformaldehyde and co-cultured with BMSCs at a ratio of 1∶1.1.0×106mixed cells were centrifuged at 2 000 r/min for 8 min to form a cell pellet.The mixture of normal chondrocytes and BMSCs and the pure normal chondrocytes were respectively centrifuged likewise as positive controls(Ctrl 1 and Ctrl 2).The BMSCs and inactivated chondrocytes were respectively centrifuged likewise as negative controls(Ctrl 3 and Ctrl 4).All the pellets were cultured in regular media for 4 weeks and then evaluated for chondrogenic phenotype by staining with HE and Safranin O,and immunohistochemically with typeⅡcollagen.Expression of cartilage specific genes was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). There were 3 specimens in each group.Resultsthe specimens of BMSCs plus fixed chondrocytes failed to form cartilagelike tissue with negative expression of cartilage specific matrices at both gene and protein levels.The pellets in positive controls formed the mature lacuna structures and metachromatic matrices.CollagenⅡexpression could be observed by immunohistochemistry and RT-PCR examination.The specimens in negative controls formed fibrous tissues.Conclusion The cell-cell contact alone between chondrocytes and BMSCs was not enough to initiate chondrogenic differentiation of BMSCs.

Bone marrow stromal cells;Chondrocytes;Cell-cell contact;Paraformaldehyde;Chondrogenesis

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）02－0070－05

2010年1月5日；

2010年3月17日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.003

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（2005CB522702）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA02A126）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30801192，30973131，30772264）；上海市曙光計(jì)劃項(xiàng)目（08SG19）；上海市科技啟明星跟蹤計(jì)劃（09QH1401600）。

100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院（劉霞，曹誼林）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（周廣東，劉偉，曹誼林）。

周廣東。