在兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建組織工程管狀軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

羅旭松 楊健 劉偉 張文杰 崔磊 周廣東 曹誼林

在兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建組織工程管狀軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

羅旭松 楊健 劉偉 張文杰 崔磊 周廣東 曹誼林

目的了解兔頸部胸骨舌骨肌的血供解剖特點(diǎn)，并嘗試在該肌肉內(nèi)構(gòu)建組織工程管狀軟骨。方法用紅色乳膠灌注新西蘭兔的動(dòng)脈系統(tǒng)，顯示營(yíng)養(yǎng)胸骨舌骨肌的動(dòng)脈血管分布情況。將兔自體軟骨細(xì)胞-PGA/PLA復(fù)合物在體外培養(yǎng)2周后，植入兔胸骨舌骨肌內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4周，取材進(jìn)行相應(yīng)的組織學(xué)檢測(cè)，并與正常兔氣管組織進(jìn)行比較。結(jié)果兔胸骨舌骨肌由頸總動(dòng)脈的2個(gè)直接分支供血。其中第一分支的發(fā)出點(diǎn)接近胸骨舌骨肌中點(diǎn)，供應(yīng)整塊肌肉；第二分支發(fā)出點(diǎn)偏舌骨端，主要供應(yīng)肌肉上半部分。體內(nèi)培養(yǎng)4周后，在兔胸骨舌骨肌內(nèi)可見(jiàn)規(guī)則的管狀軟骨組織，表面形成致密的血管網(wǎng)絡(luò)。HE染色見(jiàn)軟骨細(xì)胞排列規(guī)則，包埋在軟骨陷窩內(nèi)，表層細(xì)胞較大、深部細(xì)胞較??；Safranin O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，表示有豐富的蛋白聚糖基質(zhì)；Ⅱ型膠原免疫組化顯示，新生軟骨陷窩周?chē)蕪?qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表明有大量Ⅱ型膠原分泌。新生軟骨的特性與正常氣管軟骨類(lèi)似。結(jié)論在兔胸骨舌骨肌內(nèi)可以構(gòu)建出滿(mǎn)意的組織工程管狀軟骨。本研究為應(yīng)用胸骨舌骨肌預(yù)構(gòu)肌肉-軟骨復(fù)合組織瓣修復(fù)氣管缺損進(jìn)行了探索。

組織工程軟骨胸骨舌骨肌

各種原因（先天畸形、外傷、腫瘤等）造成的氣管缺損在臨床上較為常見(jiàn)，如果缺損范圍較大，需要手術(shù)修復(fù)，手術(shù)的關(guān)鍵在于重建能起到支撐作用的軟骨組織。以往曾采用自體組織、異體組織和人工材料等進(jìn)行修復(fù)，但是都存在各種缺點(diǎn)[1－2]。近年來(lái)，人們嘗試使用組織工程化管狀軟骨進(jìn)行氣管重建，有望成為一種理想的修復(fù)手段[3－4]。目前，大多數(shù)研究是將體外或體內(nèi)構(gòu)建的組織工程化軟骨，通過(guò)游離移植修復(fù)缺損，需要在受區(qū)建立血運(yùn)。而氣管部位血運(yùn)并不豐富，難以快速重建血運(yùn)。

為此，我們?cè)O(shè)想在氣管鄰近的肌肉內(nèi)構(gòu)建管狀軟骨，然后以該肌肉攜帶組織工程化管狀軟骨，帶蒂修復(fù)氣管缺損，從而達(dá)到自帶血供的目的。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[5－6]，選擇兔胸骨舌骨肌進(jìn)行可行性驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中，我們研究兔胸骨舌骨肌的血供情況，并嘗試?yán)闷鋽y帶組織工程化管狀軟骨修復(fù)氣管缺損。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只成年新西蘭白兔（上海川沙動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)），雄雌各半，6只用于解剖研究，6只用于管狀軟骨構(gòu)建。

1.2 方法

1．2．1 兔胸骨舌骨肌的解剖研究

兔麻醉處死后，剖開(kāi)腹腔，分離出腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，從下腔靜脈放血，結(jié)扎腹主動(dòng)脈，從結(jié)扎處近端穿刺置管，向腹主動(dòng)脈內(nèi)先推注含肝素的生理鹽水清洗血管系統(tǒng)，然后推注紅色乳膠灌注動(dòng)脈系統(tǒng)，動(dòng)物置于室溫（10℃）下48 h等待乳膠凝固。

仰臥頸伸位固定動(dòng)物，從正中線(xiàn)切開(kāi)頸部皮膚和皮下組織，在此層次向兩側(cè)分離，充分暴露出頸前區(qū)肌肉，可見(jiàn)胸骨舌骨肌的舌骨端。兩側(cè)胸鎖乳突肌位于胸骨舌骨肌下1/3部分的淺層，離斷胸鎖乳突肌的胸骨端后可充分顯露胸骨舌骨肌的胸骨端（圖1A），從正中線(xiàn)分離兩側(cè)胸骨舌骨肌，可見(jiàn)緊貼下方的兔喉部和頸部氣管（圖1B），在氣管旁溝里有乳膠灌注顯色的頸總動(dòng)脈，牽起后可見(jiàn)其分支（圖1C），修去結(jié)締組織，充分顯露頸總動(dòng)脈及分支。

1.2.2 帶蒂組織工程軟骨的構(gòu)建和檢測(cè)

1.2.2.1 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下切取兔耳廓1 cm×1 cm大小的軟骨塊，消化分離出軟骨細(xì)胞[6-7]，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3 d后首次換液，以后隔日換液。原代軟骨細(xì)胞12～24 h貼壁，由圓形逐漸伸展呈橢圓形、三角形和多角形，形成獨(dú)立的同源細(xì)胞群，隨后細(xì)胞群落逐漸擴(kuò)展融合。傳代后軟骨細(xì)胞增長(zhǎng)加速，分裂細(xì)胞多見(jiàn)，大多是多角形，一般5～7 d即可達(dá)到90%以上的融合狀態(tài)。免疫熒光染色顯示，細(xì)胞核PI襯染為紅色，表達(dá)Ⅱ型膠原的細(xì)胞漿染為綠色（圖2A）。傳至第2～3代，細(xì)胞量達(dá)到6～8×107個(gè)時(shí)，即可用于管狀軟骨的構(gòu)建。

1.2.2.2 軟骨細(xì)胞-PLA/PGA復(fù)合物的體外構(gòu)建

聚乳酸/聚乙醇酸復(fù)合纖維（PLA∶PGA＝1∶99）80mg，用75%乙醇浸泡60min消毒、PBS沖洗2次后，均勻纏繞在長(zhǎng)為1.5 cm、直徑為6 mm的硅膠模具上，成為圓筒形支架材料（圖2B）。將6×107cells/mL的軟骨細(xì)胞懸液1 mL，均勻接種于支架材料，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)4 h，移入50 mL聚丙烯離心管（BD Biosciences公司），加入30 mL軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，隔日換液，繼續(xù)培養(yǎng)2周。

1.2.2.3 兔胸骨舌骨肌內(nèi)植入細(xì)胞-材料復(fù)合物

用氯氨酮（5mg/kg）和速眠新（0.05～1m L/kg）肌注，麻醉實(shí)驗(yàn)用兔，頸部剃毛，常規(guī)新潔爾滅酊消毒、鋪巾，頸部正中切口暴露出胸骨舌骨肌，將兔自體軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物置于肌肉表面（圖2C），以6-0可吸收線(xiàn)縫合肌肉兩側(cè)，將復(fù)合物包裹入內(nèi)（圖2D），關(guān)閉切口。術(shù)后單籠常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)3 d肌注青霉素，每次10萬(wàn)單位，每日2次。

1.2.2.4 組織學(xué)檢測(cè)

術(shù)后4周取材，標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色、Safranin O特殊染色和Ⅱ型膠原ABC法免疫組化染色。

2 結(jié)果

2.1 兔胸骨舌骨肌的血供解剖特點(diǎn)

4只實(shí)驗(yàn)用兔的胸骨舌骨肌，由頸總動(dòng)脈主干的兩個(gè)直接分支供血（圖1C）：第一分支發(fā)出位置接近肌肉中部、偏舌骨端，進(jìn)入肌肉后分叉為升支和降支，分別供應(yīng)肌肉的上半和下半部分（圖1D）；第二分支位于肌肉中上1/3處，供應(yīng)同側(cè)肌肉的上半部分（圖1E）。兩分支的直徑大致相等，約0.3～0.4mm，發(fā)出位置較固定，均有伴行靜脈。另外2只兔的第二分支比第一分支粗，從頸總動(dòng)脈發(fā)出后很快再分成4支，1支供應(yīng)同側(cè)胸骨舌骨肌，其余3支供應(yīng)下頜下腺、喉部和頸部其他肌肉（圖1F）。

2.2 兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建的組織工程軟骨檢測(cè)

2.2.1 大體觀察

在肌肉內(nèi)構(gòu)建4周后，細(xì)胞-材料復(fù)合物形成了與肌肉緊密相連的管狀軟骨，表面有豐富的血管網(wǎng)（圖2E，F(xiàn)）。軟骨彈性良好（圖3A），撤出硅膠模具后可耐受橫切面上的反復(fù)壓縮（模擬呼吸時(shí)的正負(fù)壓波動(dòng)）和縱向的反復(fù)彎曲（模擬頸部的活動(dòng)）。

2.2.2 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

HE染色顯示，組織工程化管狀軟骨的細(xì)胞排列規(guī)則，包埋于軟骨陷窩內(nèi)，軟骨表層細(xì)胞較大、圓形，深部為較小的同源軟骨細(xì)胞群。Saffarin O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，提示有蛋白聚糖基質(zhì)生成。Ⅱ型膠原免疫組化顯示，新生軟骨陷窩周?chē)蕪?qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（棕黃色），表明有大量軟骨特異性蛋白Ⅱ型膠原分泌（圖3B－D），與正常兔氣管軟骨相似（圖3F－H)。

圖1 兔胸骨舌骨肌的血供解剖

圖2 胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建管狀軟骨

圖3 管狀軟骨大體觀和組織學(xué)（上）與正常兔氣管（下）相似

3 討論

利用組織工程技術(shù)構(gòu)建的組織，如能在修復(fù)部位快速建立血供，將有利于組織的成活。當(dāng)構(gòu)建組織的體積較大，或是缺損范圍大、局部血供差、瘢痕嚴(yán)重、存在感染時(shí)，血供尤其關(guān)鍵[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在材料支架上結(jié)合VEGF、PDGF和肝素等因子，可以促進(jìn)血管生成[9－10]。另有報(bào)道利用微電子機(jī)械或微液流技術(shù)，在材料內(nèi)部構(gòu)造出模擬微血管分支的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可使接種在材料內(nèi)部的細(xì)胞80%以上保持活力[11－12]。此外，還有研究利用自體血管化的能力，在循環(huán)豐富的組織內(nèi)植入構(gòu)建組織[13-14]，生成組織的質(zhì)量?jī)?yōu)于單純體外構(gòu)建的組織。后者特別適合用于構(gòu)建本身不含血管的軟骨組織。

胸骨舌骨肌緊鄰喉、氣管，常將其設(shè)計(jì)成雙蒂或單蒂的?。ㄆぃ┌曛苯愚D(zhuǎn)位修復(fù)喉、氣管缺損，操作簡(jiǎn)單、效果可靠[15-16]。只要術(shù)中不影響肌肉的起止點(diǎn)和神經(jīng)支配，就不會(huì)影響修復(fù)后的肌肉功能。胸骨舌骨肌的止點(diǎn)位于喉與氣管平面的前方，當(dāng)肌肉收縮時(shí)會(huì)產(chǎn)生向前的牽引力，從而可保持重建氣管的通暢。兔胸骨舌骨肌主要由頸總動(dòng)脈發(fā)出兩個(gè)直接分支供應(yīng)。按照Mathes等[17]對(duì)肌肉的血供分類(lèi)方法，兔胸骨舌骨肌應(yīng)屬Ⅱ型，即第一分支為主要血管、第二分支為次要血管。在注意保護(hù)好這兩個(gè)分支，尤其是第一分支的前提下，可將兔胸骨舌骨肌-軟骨復(fù)合瓣設(shè)計(jì)成雙蒂或單蒂，以滿(mǎn)足氣管缺損修復(fù)的需要。

本實(shí)驗(yàn)嘗試在兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建管狀軟骨，利用其豐富的血管和營(yíng)養(yǎng)，生成了與正常氣管軟骨類(lèi)似組織。在后續(xù)研究中，我們將考慮利用肌肉-管狀軟骨復(fù)合瓣修復(fù)兔氣管節(jié)段性缺損，以期為臨床應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)或重建氣管提供參考。

[1]Grillo HC.Tracheal replacement:a critical review[J].Ann Thorac Surg,2002,73(6):1995-2004.

[2]HabalMB.Tracheal reconstruction:attempts inmore than 50 years [J].JCraniofac Surg,2009,20(3):872.

[3]Vacanti CA,Paige KT,Kim WS,et al.Experimental tracheal replacement using tissue-engineered cartilage[J].JPediatr Surg, 1994,29:201-205.

[4]Macchiarini P,Jungebluth P,Go T,et al.Clinical transplantation of a tissue-engineered airway[J].Lancet,2008,372(9655):2023-2030.

[5]Xiao K,Zhou G,Liu W,et al.Experimental study of repairing rabbit tracheal defects by tissue engineered tubular cartilage[J]. Chin JThorac Cardiovasc Surg,2006,22(1):45-48.

[6]Luo X,Zhou G,Liu W,et al.In vitro precultivation alleviates post-implantation inflammation and enhancesdevelopmentof tissue engineered tubular cartilage[J].Biomed Mater,2009,4(2):25-26.

[7]Zhou G,LiuW,Cui L,et al.In vivo chondrogenesis of BMSCs at non-chondrogenesis site by co-transplantation of BMSCs and chondrocytes with pluronic as biomaterial[J].Key Engineering Materials,2005,288-289:3-6.

[8]Lovett M,Lee K,Edwards A,et al.Vascularization strategies for tissue engineering[J].Tissue Eng Part BRev,2009,15(3):353-370.

[9]Zisch AH,Lutolf MP,Hubbell JA.Biopolymeric deliverymatrices for angiogenic growth factors[J].Cardiovasc Pathol,2003(12):295-310.

[10]Zhang G,Suggs LJ.Matrices and scaffolds for drug delivery in vascular tissue engineering[J].Adv Drug Deliv Rev,2007,59(4-5): 360-373.

[11]Nazhat SN,Neel EA,Kidane A,et al.Controlled microchannelling in dense collagen scaffolds by soluble phosphate glass fibers[J]. Biomacromolecules,2007,8(2):543-551.

[12]Song YS,Lin RL,MontesanoG,etal.Engineered 3D tissuemodels for cell-ladenmicrofluidic channels[J].Anal Bioanal Chem,2009, 395(1):185-193.

[13]NeumeisterMW,Wu T,ChambersC.Vascularized tissue-engineered ears[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):116-122.

[14]Beier JP,Horch RE,Hess A,etal.Axial vascularization ofa large volume calcium phosphate ceramic bone substitute in thesheep AV loop model[J].JTissue Eng Regen Med,2009,4(3):216-223.

[15]Papay FA,Eliachar I,Stein JM,et al.Structural stability of the rotary doormyocutaneous flap[J].Laryngoscope,1998,108(3):385-392.

[16]ChenWX,Ruan YY,CuiPC,etal.Long-term resultsofthesternohyoid myocutaneous rotary door flap for laryngotracheal reconstruction [J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2002,111(1):93-95.

[17]MathesSJ,NahaiF.Classification of thevascularanatomyofmuscles: experimentaland clinical correlation[J].PlastReconstr Surg,1981, 67(2):177-187.

Experimental Research on Tubular Cartilage Engineering in Rabbit Sternohyoid Muscle

LUO Xusong1,YANG Jian2, LIUWei1,ZHANGWenjie1,CUILei1,ZHOU Guangdong1,CAO Yilin1.
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Nin th People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Shanghai Pulmonary Hospital,TongjiUniversity,Shanghai200433,China.Corresponding authors:ZHOU Guangdong,CAO Yilin.

ObjectiveTo explore the vascular anatomy of rabbit sternohyoid muscle and construct tubular cartilage inside themuscle.MethodsRed latex perfusion was used to analyze the vascular pattern of rabbit sternohyoid muscle. Autologous chondrocyte-PLA/PGA constructs were pre-cultured for 2 weeks in vitro,wrapped by sternohyoid muscle for another 4 weeks,and then harvested for gross observation and histological analysis.Normal rabbit tracheal cartilage served as control.ResultsRabbit sternohyoid muscle was directly supplied by two branches from common carotid artery.One branch entered themuscle in themiddle and supplied the wholemuscle,while the other entered beside the hyoid end and supplied the upper half.After 4 weeks of culture in muscle pocket,the cell-scaffold construct developed into a cartilage tube with dense anastomosis on its surface.HE staining showed that the chondrocytes were arranged regularly in lacuna，with large cells on the surface and small cells in the deep.Safranin O staining showed strong positive results,indicating abundant proteoglycan in thematrix.Immunochemistry showed strong positive results around the lacune,suggestingmassive typeⅡcollagen secretion.All indicated that the neo-cartilage had similar properties to normal rabbit tracheal cartilage.ConclusionThe pocket of sternohyoid muscle is an ideal site for cartilage engineering in vivo.The resultsmay act as an experimental basis for further prefabrication ofmuscle-cartilage composite in the repair of tracheal defect.

Tissue engineering;Cartilage;Sternohyoidmuscle

book=78,ebook=20

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）02－0078－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.005

2010年1月19日；

2010年2月15日)

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（羅旭松，劉偉，張文杰，崔磊，周廣東，曹誼林）；200433上海市同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院（楊健）。

周廣東，曹誼林。