• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    在兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建組織工程管狀軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

    2010-09-02 01:56:44羅旭松楊健劉偉張文杰崔磊周廣東曹誼林
    組織工程與重建外科雜志 2010年2期
    關(guān)鍵詞:舌骨管狀胸骨

    羅旭松 楊健 劉偉 張文杰 崔磊 周廣東 曹誼林

    在兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建組織工程管狀軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

    羅旭松 楊健 劉偉 張文杰 崔磊 周廣東 曹誼林

    目的了解兔頸部胸骨舌骨肌的血供解剖特點(diǎn),并嘗試在該肌肉內(nèi)構(gòu)建組織工程管狀軟骨。方法用紅色乳膠灌注新西蘭兔的動(dòng)脈系統(tǒng),顯示營(yíng)養(yǎng)胸骨舌骨肌的動(dòng)脈血管分布情況。將兔自體軟骨細(xì)胞-PGA/PLA復(fù)合物在體外培養(yǎng)2周后,植入兔胸骨舌骨肌內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4周,取材進(jìn)行相應(yīng)的組織學(xué)檢測(cè),并與正常兔氣管組織進(jìn)行比較。結(jié)果兔胸骨舌骨肌由頸總動(dòng)脈的2個(gè)直接分支供血。其中第一分支的發(fā)出點(diǎn)接近胸骨舌骨肌中點(diǎn),供應(yīng)整塊肌肉;第二分支發(fā)出點(diǎn)偏舌骨端,主要供應(yīng)肌肉上半部分。體內(nèi)培養(yǎng)4周后,在兔胸骨舌骨肌內(nèi)可見(jiàn)規(guī)則的管狀軟骨組織,表面形成致密的血管網(wǎng)絡(luò)。HE染色見(jiàn)軟骨細(xì)胞排列規(guī)則,包埋在軟骨陷窩內(nèi),表層細(xì)胞較大、深部細(xì)胞較??;Safranin O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性,表示有豐富的蛋白聚糖基質(zhì);Ⅱ型膠原免疫組化顯示,新生軟骨陷窩周?chē)蕪?qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),表明有大量Ⅱ型膠原分泌。新生軟骨的特性與正常氣管軟骨類(lèi)似。結(jié)論在兔胸骨舌骨肌內(nèi)可以構(gòu)建出滿(mǎn)意的組織工程管狀軟骨。本研究為應(yīng)用胸骨舌骨肌預(yù)構(gòu)肌肉-軟骨復(fù)合組織瓣修復(fù)氣管缺損進(jìn)行了探索。

    組織工程軟骨胸骨舌骨肌

    各種原因(先天畸形、外傷、腫瘤等)造成的氣管缺損在臨床上較為常見(jiàn),如果缺損范圍較大,需要手術(shù)修復(fù),手術(shù)的關(guān)鍵在于重建能起到支撐作用的軟骨組織。以往曾采用自體組織、異體組織和人工材料等進(jìn)行修復(fù),但是都存在各種缺點(diǎn)[1-2]。近年來(lái),人們嘗試使用組織工程化管狀軟骨進(jìn)行氣管重建,有望成為一種理想的修復(fù)手段[3-4]。目前,大多數(shù)研究是將體外或體內(nèi)構(gòu)建的組織工程化軟骨,通過(guò)游離移植修復(fù)缺損,需要在受區(qū)建立血運(yùn)。而氣管部位血運(yùn)并不豐富,難以快速重建血運(yùn)。

    為此,我們?cè)O(shè)想在氣管鄰近的肌肉內(nèi)構(gòu)建管狀軟骨,然后以該肌肉攜帶組織工程化管狀軟骨,帶蒂修復(fù)氣管缺損,從而達(dá)到自帶血供的目的。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[5-6],選擇兔胸骨舌骨肌進(jìn)行可行性驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中,我們研究兔胸骨舌骨肌的血供情況,并嘗試?yán)闷鋽y帶組織工程化管狀軟骨修復(fù)氣管缺損。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    12只成年新西蘭白兔(上海川沙動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)),雄雌各半,6只用于解剖研究,6只用于管狀軟骨構(gòu)建。

    1.2 方法

    1.2.1 兔胸骨舌骨肌的解剖研究

    兔麻醉處死后,剖開(kāi)腹腔,分離出腹主動(dòng)脈和下腔靜脈,從下腔靜脈放血,結(jié)扎腹主動(dòng)脈,從結(jié)扎處近端穿刺置管,向腹主動(dòng)脈內(nèi)先推注含肝素的生理鹽水清洗血管系統(tǒng),然后推注紅色乳膠灌注動(dòng)脈系統(tǒng),動(dòng)物置于室溫(10℃)下48 h等待乳膠凝固。

    仰臥頸伸位固定動(dòng)物,從正中線(xiàn)切開(kāi)頸部皮膚和皮下組織,在此層次向兩側(cè)分離,充分暴露出頸前區(qū)肌肉,可見(jiàn)胸骨舌骨肌的舌骨端。兩側(cè)胸鎖乳突肌位于胸骨舌骨肌下1/3部分的淺層,離斷胸鎖乳突肌的胸骨端后可充分顯露胸骨舌骨肌的胸骨端(圖1A),從正中線(xiàn)分離兩側(cè)胸骨舌骨肌,可見(jiàn)緊貼下方的兔喉部和頸部氣管(圖1B),在氣管旁溝里有乳膠灌注顯色的頸總動(dòng)脈,牽起后可見(jiàn)其分支(圖1C),修去結(jié)締組織,充分顯露頸總動(dòng)脈及分支。

    1.2.2 帶蒂組織工程軟骨的構(gòu)建和檢測(cè)

    1.2.2.1 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

    無(wú)菌條件下切取兔耳廓1 cm×1 cm大小的軟骨塊,消化分離出軟骨細(xì)胞[6-7],37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),3 d后首次換液,以后隔日換液。原代軟骨細(xì)胞12~24 h貼壁,由圓形逐漸伸展呈橢圓形、三角形和多角形,形成獨(dú)立的同源細(xì)胞群,隨后細(xì)胞群落逐漸擴(kuò)展融合。傳代后軟骨細(xì)胞增長(zhǎng)加速,分裂細(xì)胞多見(jiàn),大多是多角形,一般5~7 d即可達(dá)到90%以上的融合狀態(tài)。免疫熒光染色顯示,細(xì)胞核PI襯染為紅色,表達(dá)Ⅱ型膠原的細(xì)胞漿染為綠色(圖2A)。傳至第2~3代,細(xì)胞量達(dá)到6~8×107個(gè)時(shí),即可用于管狀軟骨的構(gòu)建。

    1.2.2.2 軟骨細(xì)胞-PLA/PGA復(fù)合物的體外構(gòu)建

    聚乳酸/聚乙醇酸復(fù)合纖維(PLA∶PGA=1∶99)80mg,用75%乙醇浸泡60min消毒、PBS沖洗2次后,均勻纏繞在長(zhǎng)為1.5 cm、直徑為6 mm的硅膠模具上,成為圓筒形支架材料(圖2B)。將6×107cells/mL的軟骨細(xì)胞懸液1 mL,均勻接種于支架材料,37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)4 h,移入50 mL聚丙烯離心管(BD Biosciences公司),加入30 mL軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液,隔日換液,繼續(xù)培養(yǎng)2周。

    1.2.2.3 兔胸骨舌骨肌內(nèi)植入細(xì)胞-材料復(fù)合物

    用氯氨酮(5mg/kg)和速眠新(0.05~1m L/kg)肌注,麻醉實(shí)驗(yàn)用兔,頸部剃毛,常規(guī)新潔爾滅酊消毒、鋪巾,頸部正中切口暴露出胸骨舌骨肌,將兔自體軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物置于肌肉表面(圖2C),以6-0可吸收線(xiàn)縫合肌肉兩側(cè),將復(fù)合物包裹入內(nèi)(圖2D),關(guān)閉切口。術(shù)后單籠常規(guī)飼養(yǎng),連續(xù)3 d肌注青霉素,每次10萬(wàn)單位,每日2次。

    1.2.2.4 組織學(xué)檢測(cè)

    術(shù)后4周取材,標(biāo)本用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,行HE染色、Safranin O特殊染色和Ⅱ型膠原ABC法免疫組化染色。

    2 結(jié)果

    2.1 兔胸骨舌骨肌的血供解剖特點(diǎn)

    4只實(shí)驗(yàn)用兔的胸骨舌骨肌,由頸總動(dòng)脈主干的兩個(gè)直接分支供血(圖1C):第一分支發(fā)出位置接近肌肉中部、偏舌骨端,進(jìn)入肌肉后分叉為升支和降支,分別供應(yīng)肌肉的上半和下半部分(圖1D);第二分支位于肌肉中上1/3處,供應(yīng)同側(cè)肌肉的上半部分(圖1E)。兩分支的直徑大致相等,約0.3~0.4mm,發(fā)出位置較固定,均有伴行靜脈。另外2只兔的第二分支比第一分支粗,從頸總動(dòng)脈發(fā)出后很快再分成4支,1支供應(yīng)同側(cè)胸骨舌骨肌,其余3支供應(yīng)下頜下腺、喉部和頸部其他肌肉(圖1F)。

    2.2 兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建的組織工程軟骨檢測(cè)

    2.2.1 大體觀察

    在肌肉內(nèi)構(gòu)建4周后,細(xì)胞-材料復(fù)合物形成了與肌肉緊密相連的管狀軟骨,表面有豐富的血管網(wǎng)(圖2E,F(xiàn))。軟骨彈性良好(圖3A),撤出硅膠模具后可耐受橫切面上的反復(fù)壓縮(模擬呼吸時(shí)的正負(fù)壓波動(dòng))和縱向的反復(fù)彎曲(模擬頸部的活動(dòng))。

    2.2.2 組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

    HE染色顯示,組織工程化管狀軟骨的細(xì)胞排列規(guī)則,包埋于軟骨陷窩內(nèi),軟骨表層細(xì)胞較大、圓形,深部為較小的同源軟骨細(xì)胞群。Saffarin O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性,提示有蛋白聚糖基質(zhì)生成。Ⅱ型膠原免疫組化顯示,新生軟骨陷窩周?chē)蕪?qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(棕黃色),表明有大量軟骨特異性蛋白Ⅱ型膠原分泌(圖3B-D),與正常兔氣管軟骨相似(圖3F-H)。

    圖1 兔胸骨舌骨肌的血供解剖

    圖2 胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建管狀軟骨

    圖3 管狀軟骨大體觀和組織學(xué)(上)與正常兔氣管(下)相似

    3 討論

    利用組織工程技術(shù)構(gòu)建的組織,如能在修復(fù)部位快速建立血供,將有利于組織的成活。當(dāng)構(gòu)建組織的體積較大,或是缺損范圍大、局部血供差、瘢痕嚴(yán)重、存在感染時(shí),血供尤其關(guān)鍵[8]。研究發(fā)現(xiàn),在材料支架上結(jié)合VEGF、PDGF和肝素等因子,可以促進(jìn)血管生成[9-10]。另有報(bào)道利用微電子機(jī)械或微液流技術(shù),在材料內(nèi)部構(gòu)造出模擬微血管分支的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可使接種在材料內(nèi)部的細(xì)胞80%以上保持活力[11-12]。此外,還有研究利用自體血管化的能力,在循環(huán)豐富的組織內(nèi)植入構(gòu)建組織[13-14],生成組織的質(zhì)量?jī)?yōu)于單純體外構(gòu)建的組織。后者特別適合用于構(gòu)建本身不含血管的軟骨組織。

    胸骨舌骨肌緊鄰喉、氣管,常將其設(shè)計(jì)成雙蒂或單蒂的?。ㄆぃ┌曛苯愚D(zhuǎn)位修復(fù)喉、氣管缺損,操作簡(jiǎn)單、效果可靠[15-16]。只要術(shù)中不影響肌肉的起止點(diǎn)和神經(jīng)支配,就不會(huì)影響修復(fù)后的肌肉功能。胸骨舌骨肌的止點(diǎn)位于喉與氣管平面的前方,當(dāng)肌肉收縮時(shí)會(huì)產(chǎn)生向前的牽引力,從而可保持重建氣管的通暢。兔胸骨舌骨肌主要由頸總動(dòng)脈發(fā)出兩個(gè)直接分支供應(yīng)。按照Mathes等[17]對(duì)肌肉的血供分類(lèi)方法,兔胸骨舌骨肌應(yīng)屬Ⅱ型,即第一分支為主要血管、第二分支為次要血管。在注意保護(hù)好這兩個(gè)分支,尤其是第一分支的前提下,可將兔胸骨舌骨肌-軟骨復(fù)合瓣設(shè)計(jì)成雙蒂或單蒂,以滿(mǎn)足氣管缺損修復(fù)的需要。

    本實(shí)驗(yàn)嘗試在兔胸骨舌骨肌內(nèi)構(gòu)建管狀軟骨,利用其豐富的血管和營(yíng)養(yǎng),生成了與正常氣管軟骨類(lèi)似組織。在后續(xù)研究中,我們將考慮利用肌肉-管狀軟骨復(fù)合瓣修復(fù)兔氣管節(jié)段性缺損,以期為臨床應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)或重建氣管提供參考。

    [1]Grillo HC.Tracheal replacement:a critical review[J].Ann Thorac Surg,2002,73(6):1995-2004.

    [2]HabalMB.Tracheal reconstruction:attempts inmore than 50 years [J].JCraniofac Surg,2009,20(3):872.

    [3]Vacanti CA,Paige KT,Kim WS,et al.Experimental tracheal replacement using tissue-engineered cartilage[J].JPediatr Surg, 1994,29:201-205.

    [4]Macchiarini P,Jungebluth P,Go T,et al.Clinical transplantation of a tissue-engineered airway[J].Lancet,2008,372(9655):2023-2030.

    [5]Xiao K,Zhou G,Liu W,et al.Experimental study of repairing rabbit tracheal defects by tissue engineered tubular cartilage[J]. Chin JThorac Cardiovasc Surg,2006,22(1):45-48.

    [6]Luo X,Zhou G,Liu W,et al.In vitro precultivation alleviates post-implantation inflammation and enhancesdevelopmentof tissue engineered tubular cartilage[J].Biomed Mater,2009,4(2):25-26.

    [7]Zhou G,LiuW,Cui L,et al.In vivo chondrogenesis of BMSCs at non-chondrogenesis site by co-transplantation of BMSCs and chondrocytes with pluronic as biomaterial[J].Key Engineering Materials,2005,288-289:3-6.

    [8]Lovett M,Lee K,Edwards A,et al.Vascularization strategies for tissue engineering[J].Tissue Eng Part BRev,2009,15(3):353-370.

    [9]Zisch AH,Lutolf MP,Hubbell JA.Biopolymeric deliverymatrices for angiogenic growth factors[J].Cardiovasc Pathol,2003(12):295-310.

    [10]Zhang G,Suggs LJ.Matrices and scaffolds for drug delivery in vascular tissue engineering[J].Adv Drug Deliv Rev,2007,59(4-5): 360-373.

    [11]Nazhat SN,Neel EA,Kidane A,et al.Controlled microchannelling in dense collagen scaffolds by soluble phosphate glass fibers[J]. Biomacromolecules,2007,8(2):543-551.

    [12]Song YS,Lin RL,MontesanoG,etal.Engineered 3D tissuemodels for cell-ladenmicrofluidic channels[J].Anal Bioanal Chem,2009, 395(1):185-193.

    [13]NeumeisterMW,Wu T,ChambersC.Vascularized tissue-engineered ears[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):116-122.

    [14]Beier JP,Horch RE,Hess A,etal.Axial vascularization ofa large volume calcium phosphate ceramic bone substitute in thesheep AV loop model[J].JTissue Eng Regen Med,2009,4(3):216-223.

    [15]Papay FA,Eliachar I,Stein JM,et al.Structural stability of the rotary doormyocutaneous flap[J].Laryngoscope,1998,108(3):385-392.

    [16]ChenWX,Ruan YY,CuiPC,etal.Long-term resultsofthesternohyoid myocutaneous rotary door flap for laryngotracheal reconstruction [J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2002,111(1):93-95.

    [17]MathesSJ,NahaiF.Classification of thevascularanatomyofmuscles: experimentaland clinical correlation[J].PlastReconstr Surg,1981, 67(2):177-187.

    Experimental Research on Tubular Cartilage Engineering in Rabbit Sternohyoid Muscle


    LUO Xusong1,YANG Jian2, LIUWei1,ZHANGWenjie1,CUILei1,ZHOU Guangdong1,CAO Yilin1.
    1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Nin th People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Shanghai Pulmonary Hospital,TongjiUniversity,Shanghai200433,China.Corresponding authors:ZHOU Guangdong,CAO Yilin.

    ObjectiveTo explore the vascular anatomy of rabbit sternohyoid muscle and construct tubular cartilage inside themuscle.MethodsRed latex perfusion was used to analyze the vascular pattern of rabbit sternohyoid muscle. Autologous chondrocyte-PLA/PGA constructs were pre-cultured for 2 weeks in vitro,wrapped by sternohyoid muscle for another 4 weeks,and then harvested for gross observation and histological analysis.Normal rabbit tracheal cartilage served as control.ResultsRabbit sternohyoid muscle was directly supplied by two branches from common carotid artery.One branch entered themuscle in themiddle and supplied the wholemuscle,while the other entered beside the hyoid end and supplied the upper half.After 4 weeks of culture in muscle pocket,the cell-scaffold construct developed into a cartilage tube with dense anastomosis on its surface.HE staining showed that the chondrocytes were arranged regularly in lacuna,with large cells on the surface and small cells in the deep.Safranin O staining showed strong positive results,indicating abundant proteoglycan in thematrix.Immunochemistry showed strong positive results around the lacune,suggestingmassive typeⅡcollagen secretion.All indicated that the neo-cartilage had similar properties to normal rabbit tracheal cartilage.ConclusionThe pocket of sternohyoid muscle is an ideal site for cartilage engineering in vivo.The resultsmay act as an experimental basis for further prefabrication ofmuscle-cartilage composite in the repair of tracheal defect.

    Tissue engineering;Cartilage;Sternohyoidmuscle

    book=78,ebook=20

    Q813.1+2

    A

    1673-0364(2010)02-0078-04

    10.3969/j.issn.1673-0364.2010.02.005

    2010年1月19日;

    2010年2月15日)

    200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(羅旭松,劉偉,張文杰,崔磊,周廣東,曹誼林);200433上海市同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院(楊健)。

    周廣東,曹誼林。

    猜你喜歡
    舌骨管狀胸骨
    雙側(cè)雙頭胸骨肌變異1例
    電子樂(lè)園·上旬刊(2022年5期)2022-04-09 22:18:32
    板型胸骨固定系統(tǒng)與爪型胸骨固定系統(tǒng)在心臟手術(shù)中胸骨固定中應(yīng)用效果比較
    無(wú)限管狀區(qū)域上次調(diào)和函數(shù)的邊界性質(zhì)
    兒童甲狀舌管囊腫分型及舌骨選擇性保留的探討*
    舌骨形態(tài)學(xué)與顯微結(jié)構(gòu)的觀測(cè)
    雙側(cè)胸骨肌與胸鎖乳突肌相連變異一例
    用于門(mén)、百葉窗或等同物的鉸鏈
    科技資訊(2016年19期)2016-11-15 10:46:23
    雙犧牲模板法制備一維管狀Pt-Mn3O4-C復(fù)合物及其優(yōu)越的甲醇電催化氧化性能
    舌骨骨折1例
    国产在视频线精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久精品国产a三级三级三级| 国产亚洲av高清不卡| 热99国产精品久久久久久7| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲欧洲日产国产| 国产男女内射视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 又大又爽又粗| 国产xxxxx性猛交| 国产精品久久久久成人av| www.熟女人妻精品国产| e午夜精品久久久久久久| 久久精品成人免费网站| 成在线人永久免费视频| 亚洲久久久国产精品| videos熟女内射| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品久久精品一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 交换朋友夫妻互换小说| cao死你这个sao货| 国产精品欧美亚洲77777| 久久久久网色| 国产av一区二区精品久久| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 日日夜夜操网爽| 久久国产精品影院| 久久av网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产一区二区 视频在线| 国产精品免费视频内射| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜老司机福利片| av电影中文网址| 韩国精品一区二区三区| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 色婷婷av一区二区三区视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产熟女欧美一区二区| 免费观看av网站的网址| 久久青草综合色| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 男人操女人黄网站| 操出白浆在线播放| 国产成人91sexporn| 91麻豆av在线| 黄色怎么调成土黄色| 高清不卡的av网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 大陆偷拍与自拍| 国产麻豆69| 黄色毛片三级朝国网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 香蕉丝袜av| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产一区有黄有色的免费视频| 最近中文字幕2019免费版| 观看av在线不卡| 黄色a级毛片大全视频| 性色av一级| 尾随美女入室| 国产熟女午夜一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 少妇粗大呻吟视频| 免费高清在线观看日韩| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品一区二区三卡| 嫁个100分男人电影在线观看 | 亚洲成色77777| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一区二区av电影网| 不卡av一区二区三区| 一个人免费看片子| 国产亚洲精品久久久久5区| 一本色道久久久久久精品综合| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品国产av在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 成年av动漫网址| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久人人97超碰香蕉20202| 大香蕉久久网| 国产精品人妻久久久影院| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 久久久精品免费免费高清| 国产精品 国内视频| 中国国产av一级| 啦啦啦啦在线视频资源| 99国产综合亚洲精品| av片东京热男人的天堂| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费少妇av软件| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日本黄色日本黄色录像| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产片内射在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 捣出白浆h1v1| 亚洲精品乱久久久久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 男女无遮挡免费网站观看| 91精品三级在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 国产一区亚洲一区在线观看| 99九九在线精品视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲人成电影观看| 日日爽夜夜爽网站| 搡老岳熟女国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 美女扒开内裤让男人捅视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 操出白浆在线播放| 欧美日韩av久久| 亚洲成人国产一区在线观看 | 国产免费又黄又爽又色| 国产精品偷伦视频观看了| 日日夜夜操网爽| 91成人精品电影| 久久久久久久久久久久大奶| 午夜福利视频精品| 亚洲国产看品久久| 免费观看a级毛片全部| 亚洲,一卡二卡三卡| 成人国产一区最新在线观看 | 少妇 在线观看| 免费看不卡的av| 观看av在线不卡| 亚洲国产最新在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品久久久久成人av| 久久毛片免费看一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人影院久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久99精品国语久久久| 99久久综合免费| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲国产精品国产精品| 男女床上黄色一级片免费看| 最近中文字幕2019免费版| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人av教育| 精品第一国产精品| 曰老女人黄片| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线 av 中文字幕| 乱人伦中国视频| 久久鲁丝午夜福利片| 1024视频免费在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 老司机靠b影院| 免费看不卡的av| 69精品国产乱码久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 蜜桃在线观看..| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费看av在线观看网站| 男女免费视频国产| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲av欧美aⅴ国产| 9色porny在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产精品国产三级专区第一集| 日日夜夜操网爽| 天天影视国产精品| 69精品国产乱码久久久| 水蜜桃什么品种好| 天天添夜夜摸| 我的亚洲天堂| 国产在线观看jvid| 国产黄频视频在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av美国av| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美精品一区二区免费开放| netflix在线观看网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人黄色视频免费在线看| 热99国产精品久久久久久7| 91精品三级在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久欧美国产精品| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧美清纯卡通| 黄色视频不卡| 两个人看的免费小视频| 午夜影院在线不卡| 少妇人妻 视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 男女之事视频高清在线观看 | 午夜免费观看性视频| 日本一区二区免费在线视频| 国产日韩欧美视频二区| 国产av精品麻豆| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 涩涩av久久男人的天堂| 一级黄片播放器| 国产在线视频一区二区| 一区二区av电影网| 女性被躁到高潮视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲综合色网址| 99久久综合免费| 美女中出高潮动态图| 欧美xxⅹ黑人| 久久ye,这里只有精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久国产精品麻豆| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲五月婷婷丁香| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产色视频综合| 国产视频首页在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费在线观看完整版高清| 一级片免费观看大全| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| av在线老鸭窝| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一级毛片 在线播放| 国产在视频线精品| 亚洲精品一区蜜桃| 国产av精品麻豆| 亚洲成国产人片在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 男女无遮挡免费网站观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品三级大全| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 免费在线观看完整版高清| 美女主播在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产成人系列免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 97精品久久久久久久久久精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 91九色精品人成在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 青春草亚洲视频在线观看| 搡老岳熟女国产| 日本wwww免费看| 国产精品一二三区在线看| 51午夜福利影视在线观看| 午夜福利视频精品| 女性生殖器流出的白浆| 国精品久久久久久国模美| 国产又色又爽无遮挡免| 婷婷丁香在线五月| 国产成人系列免费观看| 亚洲成国产人片在线观看| 自线自在国产av| 久久性视频一级片| 激情视频va一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久综合国产亚洲精品| 人妻一区二区av| 夫妻午夜视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久国产一区二区| 精品亚洲成国产av| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久久久国产电影| 日本一区二区免费在线视频| 久久久久久久国产电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 丰满少妇做爰视频| 男女床上黄色一级片免费看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲视频免费观看视频| www.熟女人妻精品国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品一区二区三卡| 婷婷丁香在线五月| 久久狼人影院| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜影院在线不卡| 少妇人妻久久综合中文| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品国产一区二区久久| 乱人伦中国视频| 视频区图区小说| 热re99久久精品国产66热6| 久久久亚洲精品成人影院| 老司机影院成人| 久久久久精品人妻al黑| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 99re6热这里在线精品视频| 精品第一国产精品| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久人人爽人人片av| 天堂中文最新版在线下载| 大片免费播放器 马上看| 国产在线免费精品| 午夜日韩欧美国产| 最近中文字幕2019免费版| 99国产精品99久久久久| 亚洲人成77777在线视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 九草在线视频观看| 男男h啪啪无遮挡| 看十八女毛片水多多多| 91九色精品人成在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 老司机深夜福利视频在线观看 | e午夜精品久久久久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 十分钟在线观看高清视频www| 十八禁高潮呻吟视频| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩中文字幕视频在线看片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美黑人精品巨大| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品美女久久av网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 一区二区av电影网| 97在线人人人人妻| 两人在一起打扑克的视频| www.自偷自拍.com| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲精品第一综合不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| av在线老鸭窝| www.精华液| 在线观看免费视频网站a站| 多毛熟女@视频| 国产精品国产av在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久青草综合色| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产片特级美女逼逼视频| 大话2 男鬼变身卡| 欧美性长视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品偷伦视频观看了| 999精品在线视频| av福利片在线| 亚洲图色成人| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲第一青青草原| 日本av手机在线免费观看| 在线天堂中文资源库| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 另类亚洲欧美激情| 午夜免费鲁丝| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人精品无人区| 国产精品免费视频内射| 在线观看免费日韩欧美大片| 悠悠久久av| 操出白浆在线播放| 丁香六月天网| √禁漫天堂资源中文www| 国产又色又爽无遮挡免| av在线播放精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产最新在线播放| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 水蜜桃什么品种好| 久久九九热精品免费| 黄色 视频免费看| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99国产精品99久久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 狂野欧美激情性bbbbbb| 两性夫妻黄色片| 91字幕亚洲| 亚洲伊人久久精品综合| 国产又爽黄色视频| 国产高清videossex| 91精品三级在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 十八禁网站网址无遮挡| 一区二区三区乱码不卡18| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲av成人精品一二三区| 无遮挡黄片免费观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 晚上一个人看的免费电影| 精品久久久久久电影网| 一区福利在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久网色| 亚洲美女黄色视频免费看| 成人国产一区最新在线观看 | 亚洲男人天堂网一区| 一级毛片女人18水好多 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品偷伦视频观看了| 成年av动漫网址| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久热这里只有精品99| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美激情极品国产一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费观看av网站的网址| 亚洲专区国产一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 激情五月婷婷亚洲| 黄色一级大片看看| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美激情高清一区二区三区| a级毛片黄视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| av电影中文网址| 亚洲九九香蕉| 精品久久久精品久久久| 国产精品.久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看免费视频网站a站| 免费不卡黄色视频| 午夜精品国产一区二区电影| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 精品一区二区三卡| 少妇的丰满在线观看| 中文字幕制服av| 国产色视频综合| 黄色视频在线播放观看不卡| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 热re99久久国产66热| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 又大又爽又粗| 好男人电影高清在线观看| 精品久久蜜臀av无| 宅男免费午夜| av国产精品久久久久影院| 国产av精品麻豆| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久国产一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品久久久精品久久久| 日韩大码丰满熟妇| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美国产精品一级二级三级| 女人久久www免费人成看片| 老司机亚洲免费影院| 国产精品成人在线| 在线观看人妻少妇| 精品第一国产精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲五月色婷婷综合| 99热国产这里只有精品6| 国产一区有黄有色的免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久这里只有精品19| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文字幕高清在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产成人一精品久久久| 高清av免费在线| 99re6热这里在线精品视频| 婷婷色综合www| 成人手机av| 亚洲少妇的诱惑av| 中国国产av一级| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久人人爽人人片av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品人妻在线不人妻| 国产99久久九九免费精品| 久久人妻熟女aⅴ| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 色婷婷av一区二区三区视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 电影成人av| av线在线观看网站| 国产精品 欧美亚洲| 久久久国产精品麻豆| 曰老女人黄片| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产看品久久| xxxhd国产人妻xxx| 男女免费视频国产| 午夜精品国产一区二区电影| 夫妻午夜视频| 天天添夜夜摸| 午夜两性在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲久久久国产精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 两性夫妻黄色片| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产成人欧美| 91麻豆av在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 少妇人妻 视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产野战对白在线观看| 中国国产av一级| 精品免费久久久久久久清纯 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久久精品免费免费高清| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产黄频视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 久久 成人 亚洲| 婷婷色麻豆天堂久久| 91成人精品电影| 午夜免费鲁丝| 欧美在线一区亚洲| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 丰满迷人的少妇在线观看| 男女免费视频国产| 中文字幕亚洲精品专区| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲人成77777在线视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 色综合欧美亚洲国产小说| 成年人免费黄色播放视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费在线观看黄色视频的| 久久天堂一区二区三区四区| 无限看片的www在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 赤兔流量卡办理| 无限看片的www在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一区福利在线观看| 大片免费播放器 马上看| 国产精品成人在线| 国产真人三级小视频在线观看| 99国产精品99久久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日本欧美视频一区| 男男h啪啪无遮挡| 超色免费av| 日韩精品免费视频一区二区三区|