大蒜素對急性心肌缺血再灌注后心律失常和心功能影響的實(shí)驗(yàn)研究

俞飛虎 李紅霞 蘇斌杰 陳振云 劉祖秋 熊海剛 陳華山 周萬青

急性心肌梗死是指冠狀動(dòng)脈狹窄所致持續(xù)性缺血缺氧而引發(fā)心肌缺血性壞死，繼而出現(xiàn)心力衰竭、惡性心律失常甚至猝死，是臨床上較為常見的急危重癥[1-2]。及時(shí)恢復(fù)血流再灌注是臨床上的首選治療方案，但再灌注后所引發(fā)的室性心律失常以及心功能急劇減退是導(dǎo)致心源性猝死的主要原因[3]。大蒜素是一種二烯丙基三硫化物，研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠通過抑制氧化應(yīng)激損傷、改善血流動(dòng)力學(xué)對心肌缺血再灌注大鼠起到一定的保護(hù)作用[4-6]。但大蒜素對心肌梗死再灌注后心律失常和心功能的影響鮮有報(bào)道。維拉帕米是一種鈣離子拮抗劑，能夠通過抑制鈣離子內(nèi)流而減輕缺血再灌注損傷[7]，是臨床上治療心肌缺血再灌注損傷的常用藥物，并常作為陽性對照藥物用于心肌缺血再灌注損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[8]。本實(shí)驗(yàn)擬通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注模型，研究大蒜素對大鼠心肌缺血再灌注后心律失常和心功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級建康成年雄性SD 大鼠120只，體質(zhì)量250～300g，購自寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（浙）2014-0005]，動(dòng)物合格證號：20181207016。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境飼養(yǎng)1 周，光照：黑暗時(shí)間為1∶1，室溫（25±1）℃，相對濕度（60±10）%。

1.2 試驗(yàn)藥物與試劑 包括大蒜素注射液（黑龍江江世藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2ml ∶30mg，批號：20181006）；鹽酸維拉帕米注射液（黑龍江多多藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：2ml∶5mg，批號：180917）；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號：20180409、20181004、20181012）；Na+-K+-ATP酶試劑盒、Ca2+-Mg2+-ATP 酶試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：20180524、20181012）；一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：20161229、20170316）；鈣標(biāo)準(zhǔn)液（上海生物制品研究所，批號：180726）；紅四氮唑（TTC）（北京化學(xué)試劑公司，批號：171209）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 包括DH-150 型動(dòng)物呼吸機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；BL-420E 型生物信號采集儀（成都泰盟科技有限公司）；Vevo770 型超高分辨率小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)分子影像系統(tǒng)（加拿大Visual-Sonics 公司）；BH-2 型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；BS-200 型全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；RM2125 型組織切片機(jī)（德國Leica 公司）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）；DU700 型紫外-可見分光光度計(jì)（美國Beckman Coulter 公司）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將120 只大鼠分為假手術(shù)組（0.9%氯化鈉溶液）、模型組（0.9%氯化鈉溶液）、大蒜素低[5mg/（kg·d）]、中[10mg/（kg·d）]、高[20mg/（kg·d）]劑量組和維拉帕米組[2.5mg/（kg·d）]，各20 只。參照張衛(wèi)強(qiáng)等[9]的手術(shù)方法復(fù)制心肌缺血再灌注大鼠模型：以50mg/kg 劑量腹腔注射1.2%戊巴比妥鈉溶液實(shí)施麻醉，取仰臥位，行二導(dǎo)聯(lián)心電圖實(shí)時(shí)監(jiān)測，氣管切開并連接動(dòng)物呼吸機(jī)（參數(shù)設(shè)置：頻率60 次/min、潮氣量20ml/kg、呼吸比1.5∶1）；于左胸第3～4 肋骨間切開皮膚、鈍性分離開胸，充分暴露心臟、剪開心包膜，于左心耳下緣約2mm 處動(dòng)脈夾夾閉冠狀動(dòng)脈左前降支，以左心室前壁顏色呈灰白至紫紺、心電圖ST段抬高或T 波高聳為造模成功標(biāo)志，以20 萬U/kg劑量局部給予青霉素預(yù)防感染，30min 后松開動(dòng)脈夾，然后逐層縫合；假手術(shù)組除了不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支外，其余操作與模型組相同。大蒜素低、中、高劑量組和維拉帕米組給藥方法：各組大鼠均于術(shù)后第2 天開始腹腔注射給藥，1 次/d，療程4 周。

1.4.2 心律失常情況監(jiān)測及評分 監(jiān)測并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖PR 間期、QRS 間期以及ST 段變化，計(jì)算室性心動(dòng)過速（VT）、心室顫動(dòng)（VF）發(fā)生率；依照李濤等[10]的心律失常評分標(biāo)準(zhǔn)：＜5 次室性前期收縮，計(jì)0 分；≥5 次室性期前收縮，計(jì)1 分；一陣＜60s VT，計(jì)2 分；一陣≥60s VT 或多陣VT 但累計(jì)＜60s VT，計(jì)3 分；多陣VT 累計(jì)＞60s，計(jì)4 分；出現(xiàn)VF，計(jì)5 分。

1.4.3 心功能監(jiān)測 通過超高分辨率小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)分子影像系統(tǒng)進(jìn)行心功能檢測：取左心室乳頭肌水平短軸切面，測量指標(biāo)包括：左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、每搏輸出量（SV），均連續(xù)測量3 個(gè)心動(dòng)周期后取平均值。

1.4.4 心肌組織病理學(xué)檢查 采用隨機(jī)數(shù)字表法在6 組大鼠中各取6 只大鼠，腹腔注射1.2%戊巴比妥鈉溶液麻醉后開胸取心臟組織，切取左心室部位置4%多聚甲醛溶液繼續(xù)固定72h。經(jīng)固定的左心室組織進(jìn)行石蠟包埋和切片，切片厚度2μm，經(jīng)二甲苯透明、梯度酒精脫蠟水化處理，然后行HE 染色：蘇木精溶液浸泡5min，水沖洗2 次各30s，PBS 溶液返藍(lán)，水沖洗30s，伊紅溶液浸泡30s，然后行梯度酒精脫水、二甲苯透明處理、中性樹膠封片，倒置光學(xué)顯微鏡觀察并照相保存。

1.4.5 血清心肌酶水平測定 在1.4.4 步驟取心臟前，由腹主動(dòng)脈取動(dòng)脈血并經(jīng)1 500r/min 離心10min 后取血清，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀測定血清AST、CPK、LDH 水平。

1.4.6 心臟指數(shù)和梗死體積百分比測定 采用隨機(jī)數(shù)字表法在6 組大鼠中各取6 只大鼠，麻醉后稱體質(zhì)量，開胸取心臟后稱質(zhì)量，然后計(jì)算心臟指數(shù)（心臟質(zhì)量/體質(zhì)量）；心臟稱重后立即置于-20℃冰箱凍存0.5h，進(jìn)行心臟組織切片，厚度為2mm，浸入預(yù)配置好的恒溫37℃濃度1%的TTC 溶液中，避光孵育0.5h，每5min 翻動(dòng)切片一次使之均勻著色。染色后灰白色為心肌梗死區(qū)、紅色為正常組織，拍照后應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計(jì)算切片梗死面積，腦梗死體積百分比（%）=（梗死面積×切片厚度/切片面積×切片厚度）×100%。

1.4.7 心肌生化指標(biāo)測定 取各組剩余8 只大鼠，麻醉后迅速開胸取心臟組織，于冰上剪碎后置離心管并加入9 倍量RIPA 蛋白裂解液，冰水浴中研磨勻漿，低溫高速離心（4℃，12 000r/min）15min 后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟處理后，通過紫外-可見分光光度計(jì)測定Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性；通過原子吸收光度計(jì)測定心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度；采用催化L-Arg 比色法測定NOS 活性，硝酸酶還原法檢測NO 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心電圖結(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠心電圖結(jié)果比較

由表1 可見，與假手術(shù)組比較，模型組心電圖PR 間期、QRS 間期縮短、ST 段抬高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組PR 間期、QRS 間期延長且ST段降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組PR 間期、QRS 間期及ST 段高度與維拉帕米組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 各組大鼠心律失常情況及評分比較 見表2。

表2 各組大鼠心律失常情況及評分比較

由表2 可見，與假手術(shù)組比較，模型組VT、VF發(fā)生率及心律失常評分升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組VT、VF 發(fā)生率降低（均P＜0.01），心律失常評分降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組心律失常評分較維拉帕米組降低（P＜0.05），VT、VF 發(fā)生率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見表3。

表3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

由表3 可見，與假手術(shù)組比較，模型組LVEDd、LVESd 升高，LVFS、LVEF、SV 降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或0.01）；與模型組比較，大蒜素高劑量組和維拉帕米組LVEDd 降低（均P＜0.05），大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組LVESd 降低，LVFS、LVEF、SV 升高（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組各指標(biāo)與維拉帕米組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果 見插頁圖1。

由插頁圖1 可見，假手術(shù)組心肌纖維條理清晰呈束狀，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整、排列有序；與假手術(shù)組比較，模型組呈現(xiàn)心肌纖維條理不清，出現(xiàn)斷裂和紊亂，細(xì)胞數(shù)量減少、部分細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤等病理性改變；大蒜素低、中、高劑量組和維拉帕米組較模型組心肌纖維及心肌細(xì)胞上述病變均有所減輕，其中以大蒜素高劑量組最為顯著。

2.5 各組大鼠血清心肌酶水平比較 見表4。

表4 各組大鼠血清心肌酶水平比較

由表4 可見，與假手術(shù)組比較，模型組血清AST、CPK、LDH 水平升高，差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組和維拉帕米組血清LDH 水平降低（P＜0.05 或0.01），大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組血清AST、CPK水平降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組LDH水平較維拉帕米組降低（P＜0.05），AST、CPK 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.6 各組大鼠心臟指數(shù)和梗死體積百分比比較見表5。

由表5 可見，與假手術(shù)組比較，模型組心臟指數(shù)和梗死體積百分比均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組心臟指數(shù)和梗死體積百分比均降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組心臟指數(shù)、梗死體積百分比與維拉帕米組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表5 各組大鼠心臟指數(shù)和梗死體積百分比比較

2.7 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+- ATP 酶活性及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較 見表6。

表6 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較

由表6 可見，與假手術(shù)組比較，模型組Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性降低而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組和維拉帕米組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性升高且Ca2+濃度降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性較維拉帕米組升高（P＜0.05），Na+-K+-ATP 酶活性和Ca2+濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。2.8 各組大鼠心肌組織NOS 活性及NO 含量比較見表7。

表7 各組大鼠心肌組織NOS 活性及NO 含量比較

由表7 可見，與假手術(shù)組比較，模型組NOS 活性和NO 含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素低中、高劑量組NOS 活性及NO 含量均升高（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高劑量組NOS 活性和NO 含量較維拉帕米組均升高（P＜0.05 或0.01）。

3 討論

目前，通過藥物溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）等技術(shù)手段恢復(fù)血流再灌注、搶救缺血區(qū)心肌細(xì)胞、縮小梗死面積，仍是臨床上救治急性心肌梗死患者的首選治療方案[11]。但再灌注后所引發(fā)的惡性心律失常以及心功能急劇減退是導(dǎo)致心源性猝死的主要原因，這也為研發(fā)改善急性心肌梗死患者預(yù)后的新型藥物提供了新的靶點(diǎn)。

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物。王瑞等[12]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠降低高血脂癥患者血脂和體重指數(shù)，張昆[13]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠改善血流動(dòng)力學(xué)和血液流變學(xué)。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制急性心肌缺血再灌注大鼠模型并給予大蒜素進(jìn)行干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)經(jīng)大蒜素治療能夠有效改善心肌缺血再灌注大鼠心電波形（PR 間期、QRS 間期延長且ST 段降低），抑制心肌組織病理學(xué)改變，減小心肌梗死體積、降低心臟指數(shù)（減輕心臟組織水腫），且高劑量大蒜素對心肌組織病變的抑制作用優(yōu)于維拉帕米，提示大蒜素對心肌缺血再灌注大鼠心臟組織具有一定的保護(hù)作用。

VT 和VF 是最常見的心律失常表征。本研究經(jīng)心電監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)大蒜素治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠VT、VF 發(fā)生率，明顯降低心律失常評分，并且大蒜素高劑量組心律失常評分顯著低于維拉帕米組，提示大蒜素對大鼠心肌缺血再灌注后心律失常具有明顯的抑制作用。

LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF、SV 能夠反應(yīng)心臟組織功能；正常生理狀態(tài)下，血清心肌酶（AST、CPK、LDH）水平極低，當(dāng)心肌細(xì)胞受損后細(xì)胞內(nèi)心肌酶釋放入血，導(dǎo)致血清心肌酶水平陡增，所以血清心肌酶水平能夠敏感反映心肌細(xì)胞及心功能受損程度[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠有效降低心肌缺血再灌注大鼠心臟LVEDd、LVESd 并升高LVFS、LVEF、SV，降低血清AST、CPK、LDH 水平，且大蒜素高劑量組降低血清LDH 作用優(yōu)于維拉帕米組，提示大蒜素具有改善心肌缺血再灌注大鼠心功能的作用。

能量耗竭是心肌缺血再灌注后引發(fā)心律失常的病理機(jī)制。首先，能量代謝障礙所致ATP 合成受阻、ATP 依賴性的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力降低、細(xì)胞內(nèi)Ca2+泵出能力下降，導(dǎo)致心肌細(xì)胞Ca2+超載進(jìn)而引發(fā)心律失常[15-16]；其次，ATP 合成受阻將導(dǎo)致Na+-K+-ATP 酶活力進(jìn)一步降低[17]、細(xì)胞外K+增多，導(dǎo)致缺血中央至邊緣區(qū)K+含量逐漸下降的不均勻分布態(tài)勢，這也是導(dǎo)致心律失常的重要原因之一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠明顯改善急性心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶活力并降低心肌細(xì)胞Ca2+濃度，且大蒜素高劑量組對Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力的改善作用優(yōu)于維拉帕米組，這可能是大蒜素降低大鼠急性心肌缺血再灌注后心律失常發(fā)生率的重要分子機(jī)制。

NO 是體內(nèi)非常重要的信號傳導(dǎo)因子，具有擴(kuò)張血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量、改善缺血區(qū)血流灌注、提高心肌細(xì)胞氧供/需比等而抑制心律失常發(fā)作的生理作用[18]；而NOS 是體內(nèi)促NO 生成的關(guān)鍵酶。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠有效改善急性心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞NOS 活性并提高NO含量，這可能也是大蒜素抑制心肌缺血再灌注后心律失常的重要分子機(jī)制之一。

綜上所述，大蒜素對大鼠急性心肌缺血再灌注后心律失常和心功能均具有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能與大蒜素改善心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP 酶活力、降低心肌細(xì)胞Ca2+濃度、提高NO 含量有關(guān)。