ATP生物發(fā)光技術(shù)在微生物快速檢測中的應(yīng)用

摘 要：ATP 生物發(fā)光法是一種快速的微生物檢測方法，具有簡便、靈敏度高、可實(shí)時檢測等優(yōu)點(diǎn)。本文就ATP生物發(fā)光法的檢測原理、在食品微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并對ATP生物發(fā)光法的存在的問題及今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：ATP生物發(fā)光法；微生物；快速檢測；應(yīng)用

中圖分類號：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1001-0769（2015）05-0089-02

微生物污染是導(dǎo)致食品安全問題產(chǎn)生的重要原因之一，而我國國標(biāo)對食源性致病菌的檢測涉及試驗(yàn)步驟多、操作繁瑣、耗時長，極不利于食品的生產(chǎn)和流通。因此，各種微生物快速檢測技術(shù)得到了廣泛的研究與應(yīng)用，如快速測試片技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、實(shí)時定量PCR技術(shù)、ATP生物發(fā)光技術(shù)、阻抗法等[1-3]。

1 ATP生物發(fā)光技術(shù)檢測微生物的原理

ATP生物發(fā)光技術(shù)的原理就是在熒光素酶E（lueiferase）和Mg2+的作用下，熒光素LH2（lueiferin）與ATP發(fā)生腺苷?；换罨?，活化后的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，形成了熒光素—AMP復(fù)合體，并放出焦磷酸（PPi）。該復(fù)合體被分子氧氧化，形成激發(fā)態(tài)復(fù)合物P* -E·AMP，放出CO2，當(dāng)該復(fù)合物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)射光。并最終形成氧化蟲熒光素P和AMP[4]。反應(yīng)過程如下：

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)表明，熒光素酶為非典型的Michaelis Menten氏酶[5]，最適pH值為7.5，對其作用底物之一——ATP的酶促動力學(xué)曲線呈S型。在適當(dāng)?shù)偷腁TP濃度范圍內(nèi)，其反應(yīng)的速度與ATP濃度成一級反應(yīng)的關(guān)系，即檢測的熒光值強(qiáng)度與ATP濃度成一定比例關(guān)系。對于一定生理時期內(nèi)的活體微生物，均有較恒定水平ATP含量，使得ATP濃度與活體微生物含量之間有較好的線性關(guān)系，并在微生物死亡之后，其體內(nèi)的ATP會很快被胞內(nèi)酶所降解，不會對活體微生物的測定產(chǎn)生影響。ATP這些特點(diǎn)，使ATP生物發(fā)光法成為較好的活體微生物的檢測方法。

2 ATP生物發(fā)光技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

ATP生物發(fā)光法檢測的優(yōu)點(diǎn)主要是快速、簡便、靈敏度高。從20世紀(jì)80代以來，該方法的檢測限由10-14 mol提高到了10-18 mol[5]，每次檢測微生物ATP的時間可以控制在幾分鐘之內(nèi)，是目前檢測微生物數(shù)目最快捷的方法。目前，該法已經(jīng)較為成熟地應(yīng)用在細(xì)菌總數(shù)、酵母菌以及大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌和商業(yè)無菌的快速檢測中。

2.1 在乳品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

李春艷、霍貴成等[6]研究了ATP生物發(fā)光法在生牛乳中微生物檢測的應(yīng)用，他們首先將生乳用PBS緩沖液稀釋20倍，取50 μL加入4滴體細(xì)胞裂解液（TRA）混勻并加壓過濾，然后膜上加入2滴細(xì)菌細(xì)胞裂解液（XRA），再加入50 μL發(fā)光反應(yīng)試劑，用槍反復(fù)吹吸3次后測熒光值。實(shí)驗(yàn)表明，ATP生物發(fā)光法檢測結(jié)果與培養(yǎng)及平板計數(shù)法結(jié)果之間有良好的線性關(guān)系（r=0.948 5），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（P<0.001）。

2.2 在水中微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

由于水的基質(zhì)比較簡單，同時對酶的活性影響比較小，所以目前該方法檢測水中微生物的應(yīng)用最為廣泛。吳慧清和李程思等[7]利用ATP生物發(fā)光法檢測飲用水中的微生物含量。通過平板培養(yǎng)法和生物發(fā)光法對照檢測桶裝飲用水、直飲水和人工加菌后的瓶裝飲用水中的細(xì)菌總數(shù)。他們采用微濾膜技術(shù)過濾富集水中的微生物，然后加入緩沖劑和發(fā)光劑檢測熒光值，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比較，孔徑為 0.22 μL和0.45 μL的膜截留細(xì)菌率相差不大，但0.45 μL膜過濾速度遠(yuǎn)快于0.22 μL膜。因此建議采用孔徑的0.45 μL膜。該方法操作簡單，成本低，檢測結(jié)果能夠成功反映出水中微生物總數(shù)。

2.3 在面粉中的應(yīng)用

李利霞和伍金娥等[8]優(yōu)化了ATP生物發(fā)光法，并快速檢測面粉中的微生物總數(shù)。在所優(yōu)化的方法中，D-熒光素濃度為70 mg/L，熒光素酶濃度為50 mg/L，Mg2+濃度為0.25 mmol/L。用無菌生理鹽水將面粉稀釋后，分別用ATP生物發(fā)光法和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法計菌落總數(shù)，兩者結(jié)果無顯著性差異（P>0.05），同時該法還具有良好的重現(xiàn)性（RSD=4.0 %）。實(shí)驗(yàn)證明優(yōu)化的ATP生物發(fā)光法成本低、操作簡便、反應(yīng)迅速、準(zhǔn)確可靠，能快速檢測出食品中的細(xì)菌總數(shù)。

2.4 在肉類微生物檢測中的應(yīng)用

舒伯華、孫丹陵等[9]研究了ATP生物發(fā)光法在肉類食品中污染細(xì)菌檢測的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生肉類食品由于體細(xì)胞ATP對結(jié)果的干擾較大，因此需要清除掉樣品中體細(xì)胞ATP，其采用的方法是首先用0.2 %的TritonX-100和0.15 %的apyrase混合液清除體細(xì)胞ATP，然后加入3 %的三氯乙酸混合并振搖1 min，離心后取上清液檢測ATP，該光值即為細(xì)菌ATP發(fā)光值，整個過程需15 min。而熟肉類中非細(xì)菌ATP含量低，對結(jié)果影響較小可以省略清除體細(xì)胞ATP步驟而直接測定，整個過程需4 min。測量細(xì)菌的下限為103 cfu/g。經(jīng)過38份樣品實(shí)驗(yàn)對比，ATP生物發(fā)光法檢測結(jié)果與細(xì)菌菌落平板計數(shù)方法之間具有良好的線性關(guān)系（r=0.98）。

2.5 在飲料微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

侯玉柱和田雨等[10]研究了ATP生物發(fā)光法飲料微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，ATP生物發(fā)光法與涂抹法結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)飲料行業(yè)在原輔料、機(jī)械設(shè)備表面、人員及其裝備、包裝材料、生產(chǎn)環(huán)境等關(guān)鍵控制點(diǎn)的衛(wèi)生狀況現(xiàn)場監(jiān)測與跟蹤測定，測定結(jié)果與國標(biāo)法相吻合，該方法能夠幫助飲料企業(yè)提高日常的衛(wèi)生管理工作水平，指導(dǎo)對工廠設(shè)施、設(shè)備、環(huán)境等實(shí)施清掃、洗滌和殺菌作業(yè)，及時發(fā)現(xiàn)衛(wèi)生不良事故并提出解決方案。與濾膜法結(jié)合，可增加取樣量，快速測定含菌量低的液體樣品，又能消除樣品中抑菌物質(zhì)的干擾，能夠?qū)IP系統(tǒng)清洗效果進(jìn)行評估和指導(dǎo)。研究表明，與國標(biāo)平板計數(shù)法相比，該方法還可消除樣品中抑菌物質(zhì)的干擾，方便工廠對生產(chǎn)過程衛(wèi)生狀況跟蹤把控，減少不必要的浪費(fèi)。

2.6 在物體表面微生物檢測中的應(yīng)用

曹利蓉、張偉等[11]研究了ATP生物發(fā)光法在餐具表面微生物污染檢測方面的應(yīng)用，他們首先在選定測試區(qū)域內(nèi)，滴加2滴ATP釋放液，用無菌棉拭子均勻涂抹測試樣品，采樣面積為100 cm2；然后在棉拭子頭部滴加6滴ATP釋放液，提取ATP；最后立即將拭子頭部ATP提取液點(diǎn)在檢測膜上，用ATP熒光儀測定生物發(fā)光值（RLU），同時采用國標(biāo)法檢測大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)。其中規(guī)定大腸菌群陽性為不合格，細(xì)菌總數(shù)以大于 500 cfu/100 cm2為不合格，ATP生物發(fā)光法以RLU大于600為不合格。在282份樣品中，3種檢驗(yàn)方法所測出不合格樣本的陽性率分別為23.4 %，25.5 %，29.4 %。ATP生物發(fā)光法的陽性率與大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)的陽性率沒有顯著性差異（P>0.05）。

2.7 在檢測酵母菌方面的應(yīng)用

王凌，伍金娥等研究了ATP生物發(fā)光法檢測布拉氏酵母菌總數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，ATP濃度在10 mol/mL～7 mol/mL至10 mol/mL～12 mol/mL范圍內(nèi)與生物發(fā)光值之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3；通過對酵母菌ATP提取劑的研究得出，濃度為0.015 % CTAB作用時間4 min的提取效果最好；與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法對比，ATP生物發(fā)光法檢測布拉氏酵母菌有良好的相關(guān)性（R2=0.991 9），對布拉氏酵母菌的檢測限為103 cfu/mL。

3 結(jié)論及展望

ATP生物發(fā)光法具有快速、簡單方便、靈敏度高的特點(diǎn)，與其他的微生物快速檢測方法相比有著巨大優(yōu)勢，目前在食品加工行業(yè)中正不斷推廣應(yīng)用。但該方法存在著容易受到外界因素的干擾，不能定性鑒別微生物種類，對于某些樣品的直接檢測靈敏度仍然達(dá)不到要求的缺點(diǎn)。因此，選取合適的ATP提取劑，降低外界因素的干擾，增強(qiáng)對微生物的特異性識別，提高檢測靈敏度成為改善和研究該方法的關(guān)鍵點(diǎn)。目前，新型的ATP提取劑的研制已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步。

ATP生物發(fā)光法檢測限為 103 cfu/mL，但許多致病菌的致病濃度可低至10 cfu/mL。而免疫磁分離技術(shù)（Immunomagnetic Separation，IMS）可以對樣品起到濃縮、選擇性分離的作用，因此將IMS與ATP生物發(fā)光法結(jié)合起來檢測細(xì)菌，既降低了外界因素的干擾，對微生物也具有特異性識別能力，同時又極大提高了檢測靈敏度，將是一項非常有意義的工作，已有部分國內(nèi)外學(xué)者開始研究[13，14]。另外，可以借鑒熒光毛細(xì)分析法，嘗試將毛細(xì)管引入發(fā)光檢測儀以使其小型化[15，16]。相信在不久的未來，隨著科技的不斷發(fā)展，ATP生物發(fā)光法檢測微生物的技術(shù)一定會更加成熟和完善，最終將應(yīng)用到更加廣泛的領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：（16篇，略）