EPI掃描模式篩查與鑒定畜禽產(chǎn)品中多種抗生素殘留

金 雁，李曉東，劉 瑜，蔣 施，姜玲玲，周健南，鄭 晨

(1.沈陽出入境檢驗檢疫局，沈陽 110016;2.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200233)

抗生素是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞的發(fā)育功能。目前，抗生素主要用于治療動物疾病，部分產(chǎn)品同時具有促進動物生長的作用。到目前為止，抗生素藥物在畜禽養(yǎng)殖中發(fā)揮著不可替代的作用。但是，在畜禽養(yǎng)殖中使用抗生素藥物會導(dǎo)致肉、蛋、奶中出現(xiàn)一定的殘留。抗生素殘留量達到一定程度時會對人體健康產(chǎn)生危害。我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布了《動物源性食品中獸藥殘留最高限量》，并適時修訂。目前，國家只批準(zhǔn)了土霉素、粘桿菌素、桿菌肽等20多種抗生素可作為飼料藥物添加使用，并嚴(yán)格規(guī)定了使用的動物品種、生理階段、最低用量和最高用量、使用方法、停藥期和注意事項等。濫用抗生素將危及動物、動物性食品、環(huán)境甚至人類的安全，所以監(jiān)控禁用或未批準(zhǔn)的抗生素是監(jiān)管部門的長期工作。

抗生素的檢測方法主要有微生物分析法［1］、液相色譜法［2－5］、氣相色譜質(zhì)譜法［6－7］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等［8－10］。其中，以液相色譜法最常見，但方法選擇性差，靈敏度也達不到要求。近年來，隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的普及，越來越多的實驗室選擇該設(shè)備用于抗生素的監(jiān)控。液相色譜質(zhì)譜法常用來分析一類或多種抗生素，利用保留時間和化合物的兩對離子進行定性分析。但是由于抗生素種類繁多，并且在分析過程中存在假陽性的可能，所以本研究采用MRM篩查方法結(jié)合EPI譜庫對比功能，對可疑色譜峰進行鑒定。該方法對保障我國食品安全具有重大的意義。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

儀器:ACQUITYTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司);AB Sciex Qtrap 5500三重四極桿－線性加速離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(美國AB公司);離心機(美國Thermo公司);Millipore純水機(美國Millipore公司);MG－2200氮吹儀(美國EYELA公司);CPA 225D分析天平(德國Sartorius公司)。

試劑:雙氰胺、三聚氰胺、地美硝唑、甲硝唑、克球酚、噻苯達唑、磺胺脒、奧硝唑、呋喃唑酮、特布他林、沙丁胺醇、利巴韋林、替硝唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、新諾明、磺胺噻唑、喹乙醇、阿苯達唑、磺胺異噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、去氫睪酮、甲苯咪唑、芬苯達唑、磺胺喹惡啉、萊克多巴胺、甲睪酮、磺胺多辛、磺胺間甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、奧芬達唑、呋喃它酮、頭孢氨芐、氨芐青霉素、阿莫西林、醋酸甲孕酮、醋酸氯地孕酮、林可霉素、萘夫西林、鄰氯青霉素、雙氯西林標(biāo)準(zhǔn)品均購于Sigma公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水。采用1%的乙酸乙腈溶液進行提取，用納濾級聚醚楓接枝的中空纖維素膜對樣品進行凈化。標(biāo)準(zhǔn)品用少量乙腈溶解，色譜純乙腈定容配制1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)含量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下保存，有效期為2個月。

1.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，粒徑為 1.7 μm)，柱溫為 40 ℃，進樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。流動相A為超純水，B相為乙腈。起始B相為5%乙腈，1～10 min B相梯度變化到40%，10～15 min B相梯度變化為95%，15～18 min B相維持95%，18～18.1 min B相梯度變化為5%，保持5 min。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源:ESI+;噴霧電壓(IS):5500 V;霧化氣(GS1)流量:50 mL/min;氣簾氣(CUR)流量:30 mL/min;輔助加熱氣(GS2)流量:60 L/min;離子源溫度(TEM):600℃;碰撞氣流量:5 mL/min，4種氣體均為氮氣;Q1和Q3均為單位分辨率;ESI模式、去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)見表1。

表1 化合物MRM離子對信息及參數(shù)

續(xù)表

1.4 樣品前處理

取2 g樣品，置于50 mL離心管中，加入4 mL水渦混5 min，向離心管中加入10 mL 1%的乙酸乙腈溶液，均質(zhì)提取5 min;加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鈉渦混振蕩1 min，6000 r/min離心10 min，取5 mL乙腈相到15 mL離心管中;加入5 mL正己烷渦混30 s進行反萃取，靜置1 min，棄去上層正己烷層，重復(fù)反萃取步驟1次，得到反萃取后的乙腈相;在40℃下氮吹濃縮至0.3～0.5 mL，用乙腈定容至 1 mL，過 0.22 μm 濾膜;取濾液500 μL，轉(zhuǎn)移至聚醚楓接枝的中空纖維素膜組件中，4000 r/min離心8 min，收集濾液供 LC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物質(zhì)譜條件優(yōu)化

蠕動泵以5 μL/min的流速連續(xù)注射，分別將43種質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1 μg/mL的抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液注入ESI離子源，在正離子模式下逐個掃描優(yōu)化化合物。以萊克多巴胺為例，得到化合物的標(biāo)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+302.2，優(yōu)化去簇電壓DP后得到最大強度的準(zhǔn)分子離子峰。逐步加大碰撞能量CE，找到準(zhǔn)分子離子峰最強信號強度CPS的子離子峰164.1和107.0，優(yōu)化2個碎片離子峰的碰撞能量。優(yōu)化的MRM離子對碰撞能和其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。按照預(yù)先優(yōu)化好的色譜條件采集43種抗生素的色譜圖，得到所有化合物質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 ng/mL的總離子流圖(圖1)。

圖1 抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

2.2 化合物譜庫建立

在基質(zhì)空白樣本添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后，控制進樣質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 ng/mL的樣本，分別設(shè)定20，35，50 eV碰撞能量的采集數(shù)據(jù)。將采集到的43種抗生素的二級質(zhì)譜圖添加到譜庫。同樣采集質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別設(shè)定20，35，50 eV的碰撞能量后，將二級質(zhì)譜圖添加到譜庫。此外，記錄化合物保留時間和MRM離子對信息建立文本庫(見表1)。

2.3 化合物篩查

將前面利用保留時間和MRM離子對建立的文本庫提取后整理為Excel格式存檔。存檔的格式可直接粘貼到操作軟件上。編輯液相色譜條件，建立MRM掃描方法，采集數(shù)據(jù)。對未知樣品進行篩查，在化合物濃度達到或超過檢出限時采集樣本，目標(biāo)化合物一定會出現(xiàn)色譜峰。當(dāng)未知樣品篩查分析時出現(xiàn)MRM色譜峰，則認(rèn)定樣品為陽性可疑樣品。

2.4 化合物鑒定步驟

MRM掃描方式是公認(rèn)的靈敏度最高的掃描方式，在編輯方法時設(shè)定離子對信息。如果樣本中含有MRM目標(biāo)化合物并且高于檢出限，則在總離子流圖上一定會出峰，然而出峰的不一定是目標(biāo)化合物。實驗過程中，通過設(shè)定保留時間窗口以及MRM-IDA-EPI掃描方式采集保留時間窗口內(nèi)的色譜峰。色譜峰達到IDA設(shè)定閾值條件后激發(fā)EPI，對子離子掃描譜圖進行富集，實現(xiàn)在低濃度下子離子掃描的可能。將采集的子離子掃描譜圖與本文2.2節(jié)中建立的標(biāo)準(zhǔn)譜庫進行對比，軟件自動給出匹配值，并且還可通過肉眼直觀辨識色譜峰的純度以及真?zhèn)?，以實現(xiàn)化合物鑒定步驟。

上述模式對實際陽性可疑樣品進行鑒定，獲得MRM提取離子流圖，同時采集陽性可疑樣品的EPI譜圖進行對比。

2.5 方法的檢出限、回收率

將43種抗生素混標(biāo)逐級稀釋至0.5～50 ng/mL系列濃度，采集MRM數(shù)據(jù)外標(biāo)法定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):43種抗生素在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r＞0.99。在 1，5，10 μg/kg 3個添加水平上，每個水平重復(fù)5次得到的平均回收率為69.3% ～102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～18.3%。按照基線的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 μg/kg時，信噪比均大于3;當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg時，信噪比均大于10，定為定量限。

3 結(jié)束語

本研究建立了畜禽產(chǎn)品中43種抗生素的篩查與鑒定方法，結(jié)合實驗室自建的標(biāo)準(zhǔn)譜庫可對陽性可疑樣品進行鑒定。實驗采用MRM-IDA-EPI步驟，同時實現(xiàn)對43種抗生素的監(jiān)控。該方法分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，可滿足實驗室對畜禽類產(chǎn)品的日常檢驗和分析要求。

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