白藜蘆醇抗人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞增殖及機制探索

首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（100069）李欣亞 張筱宜 趙明

白藜蘆醇（Resveratrol）簡稱Res，被認(rèn)為是最有希望的天然化學(xué)防癌劑之一。其化學(xué)名稱為三酚（3,5,4’-trihydroxystiIbege），分子式為C14H12O3，相對分子質(zhì)量為228.25[1]，屬于非黃酮類多酚化合物，分子結(jié)構(gòu)式如附圖1所示。白藜蘆醇的天然存在形式有順式和反式兩種異構(gòu)體，在植物中主要以反式異構(gòu)體形式存在，生理活性強于順式[2]。白藜蘆醇主要存在于葡萄、花生等種子植物中，在新鮮葡萄皮中的含量最高，達(dá)50～100μg/g。1997年，Jang等對白藜蘆醇在腫瘤發(fā)生、發(fā)展各階段的抑制作用進(jìn)行了初步研究[3]，此后白藜蘆醇開始腫瘤化學(xué)預(yù)防和化學(xué)治療領(lǐng)域的一個研究熱點。有研究證實，白藜蘆醇對于鼻咽癌[4]、結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]、腎小細(xì)胞癌[7]等具有抗腫瘤效應(yīng)，在腫瘤的起始、促進(jìn)、發(fā)展三個階段均有抑制作用。但迄今為止，白藜蘆醇抗腫瘤的確切機制依然未能完全闡明。

本文以反式白藜蘆醇為研究對象，采用MTT法評價體外抗人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞LO2增殖活性。在此基礎(chǔ)上，探索白藜蘆醇作用機制。一方面，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測對BXPC-3細(xì)胞周期分布和凋亡的影響；另一方面，利用紫外光譜、測定DNA粘度等手段研究與DNA的相互作用；利用分子對接的方法模擬與DNA相互作用的模式。

1 材料

1.1 細(xì)胞系BXPC-3，人原位胰腺癌細(xì)胞（來自ATCC細(xì)胞庫）；LO2，人正常肝細(xì)胞（來自ATCC細(xì)胞庫）。

1.2 主要試劑 白藜蘆醇（用含1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成所需濃度）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素（石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司）；DMSO（Hyclone公司）；CT-DNA(小牛胸腺DNA)（sigma公司，42%GC含量，為B型DNA）；PBS（每升溶液中含有NaCl8.2g，KCl0.20g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g，pH為7.4）；CT-DNA儲備液（0.0165gCT-DNA用6mL PBS溶解，濃度為c=667μM）（置于4℃冰箱冷藏保存，不超過4天）。

附圖1 反式白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)式

附圖2 白藜蘆醇抑制BXPC-3細(xì)胞生長的濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系

附圖3 白藜蘆醇影響B(tài)XPC-3細(xì)胞周期分布。注：3A.空白組BXPC-3細(xì)胞周期分布；3B.白藜蘆醇作用48h BXPC-3細(xì)胞周期分布；3C.細(xì)胞周期分布定量結(jié)果

附圖4 白藜蘆醇誘導(dǎo)BXPC-3細(xì)胞凋亡。注：4A.空白組BXPC-3細(xì)胞流式分析結(jié)果；4B.白藜蘆醇作用48h BXPC-3細(xì)胞流式分析結(jié)果；4C. 流式分析定量結(jié)果

1.3 主要儀器 高壓滅菌鍋：400 Ep-Z，Bruckmanning公司；細(xì)胞孵育箱：INC 153，memmer公司；低溫離心機：SPD 111V，Thermo公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板：Costar公司；石英自動雙重純水蒸餾器：1810-B，江蘇榮華儀器制造有限公司；流式細(xì)胞儀：COULTER EPICS@XL（貝克曼·庫爾特公司，美國）；紫外分光光度計：2550，島津公司；Ubbeholde粘度計。

2 方法

2.1 MTT法評價體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性將對數(shù)生長期的BXPC-3和LO2細(xì)胞分別以1×105個/mL的密度接種于96孔板，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，實驗組按預(yù)設(shè)濃度（依次為0.001，0.057，0.173，0.520，1.559，4.678，14.03，42.11μM，各濃度復(fù)4孔）加入白藜蘆醇，對照組加入等體積溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔加25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，置于37℃溫箱孵育4小時，除去上清液，加入DMSO，待結(jié)晶溶解，立即于酶標(biāo)儀上檢測各組細(xì)胞在570nm和630nm處的吸光度(O.D.)值。計算不同濃度白藜蘆醇對腫瘤細(xì)胞的抑制率：生長抑制率＝［（對照組平均O.D.值－樣品組平均O.D.值）/空白組平均O.D.值］×100%。用Prism計算IC50（半數(shù)有效抑制濃度）值。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測對BXPC-3細(xì)胞周期和凋亡的影響 將處于對數(shù)生長期的BXPC-3單細(xì)胞懸液接種于6孔板中（細(xì)胞數(shù)量至少1×106個/mL），給藥組加入20μL濃度為1×10-5mol/L的白藜蘆醇，對照組加含0.1%DMSO的培養(yǎng)基。孵育48小時后，收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106cells/mL。按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.3 與小牛胸腺DNA（CT-DNA）相互作用評價

2.3.1 紫外吸收光譜 配制濃度為16.7μM的CT-DNA溶液；配制濃度為21.2μM的白藜蘆醇溶液。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將4mL CT-DNA分別與20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、120μL、140μL白藜蘆醇溶液混合，在37℃溫箱中孵育三小時，依次測定紫外吸收。

2.3.2 粘度法 配制濃度為16.7μM的CTDNA溶液，溶劑為PBS緩沖液。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，向CT-DNA溶液中依次加入0.260、0.390、0.520、0.650、1.000、1.300、2.000、3.000mL濃度為42.4μM的白藜蘆醇溶液（樣品終濃度分別為0.83、1.23、1.66、2.02、3.03、3.85、5.65、7.95μM）。用Ubbeholde粘度計測定緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間t0及CT-DNA溶液（含濃度不等的白藜蘆醇）流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間t。計算相對粘度：η=(t-t0)/t。以η1/3對結(jié)合比率[白藜蘆醇]/[CT-DNA]作圖。

2.3.3 分子對接研究 采用Discovery Studio 2017 R2模擬軟件Ligandfit模塊，將白藜蘆醇和CT-DNA（PDBID：1NAB）進(jìn)行分子對接，分析白藜蘆醇和CT-DNA可能的相互作用模式。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對BXPC-3和LO2細(xì)胞增殖的影響如附圖2所示，白藜蘆醇可明顯抑制BXPC-3細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性，IC50為11.86±2μM；而對于LO2細(xì)胞幾乎沒有影響。說明白藜蘆醇抑制腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖具有一定選擇性。

3.2 白藜蘆醇對BXPC-3細(xì)胞周期和凋亡的影響 40μM白藜蘆醇作用BXPC-3細(xì)胞48h的細(xì)胞周期分布檢測結(jié)果見附圖3（AC）。與空白組相比，白藜蘆醇處理后，BXPC-3G0/G1期細(xì)胞比例從60.69提高為71.30，G2/M%期細(xì)胞比例從14.78降低為8.23，說明白藜蘆醇可以在G0/G1期阻滯BXPC-3細(xì)胞增殖。40μM白藜蘆醇作用BXPC-3細(xì)胞48h的細(xì)胞周期分布檢測結(jié)果見附圖4（A～C）。與空白組相比，白藜蘆醇處理后，BXPC-3細(xì)胞凋亡率顯著增加至50.6%。

3.3 與小牛胸腺DNA（CT-DNA）相互作用

3.3.1 紫外吸收光譜法研究白藜蘆醇與CT-DNA的相互作用 由于CT-DNA在大于300nm的范圍內(nèi)無紫外吸收，因而選擇220nm～300nm范圍測定CT-DNA以及白藜蘆醇和CT-DNA作用后的紫外光譜（附圖5）。從圖中可以看出：CT-DNA在220nm～300nm范圍內(nèi)最大吸收波長為258nm，吸收強度為1.355；隨著白藜蘆醇的含量不斷增加，CT-DNA的紫外吸收發(fā)生減色現(xiàn)象，但最大吸收波長無明顯偏移現(xiàn)象。

附圖5 白藜蘆醇含量對CT-DNA紫外吸收光譜的影響

附圖6 不同濃度白藜蘆醇對CT-DNA紫外吸收的影響

附圖7 不同濃度白藜蘆醇對CT-DNA溶液粘度的影響。注：η為溶液粘度，c（CT-DNA）=16.7μM，1–8：c（白藜蘆醇）=（0.83，1.23，1.66，2.02，3.03，3.85，5.65，7.95）μM

附圖8 白藜蘆醇與CT-DNA相互作用的分子對接。注：8A.白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)式；8B.CT-DNA的活性口袋；8C.白藜蘆醇嵌插入CT-DNA堿基對之間；8D.白藜蘆醇與堿基C和G相互作用

當(dāng)小分子和CT-DNA發(fā)生相互作用時，可引起體系中電子能級和分布的變化，可以通過紫外吸收光譜判斷它們的作用方式。一般認(rèn)為，當(dāng)這種方式是小分子插入CT-DNA分子的雙螺旋堿基之間的嵌插作用時，小分子紫外光譜的最大吸收波長向長波方向移動（通常紅移10～15nm），吸收強度降低（減色效應(yīng)，吸收強度降低30%～50%）；如果作用方式非特異性的靜電作用結(jié)合到荷負(fù)電荷的CT-DNA雙螺旋外部的溝槽作用，紫外光譜可能不表現(xiàn)上述變化，或者變化很微弱。因為當(dāng)小分子以嵌插方式結(jié)合于DNA堿基對之間時，會合堿基對發(fā)生π-π堆積效應(yīng)，與π*空軌道與堿基對的π電子軌道發(fā)生耦合，能級下降。從而導(dǎo)致π-π*躍遷能減小，其吸收光譜表現(xiàn)為峰位的紅移。耦合后π軌道因部分填充電子使π-π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生減色效應(yīng)[8][9][10]。由此推斷，白藜蘆醇與CT-DNA可能的結(jié)合模式為嵌插。

根據(jù)Stern-Volmer方程，A0/A=1+Kc[11]，A0/A對c作圖(附圖6)，用直線擬合，R2=0.9031，可由漸近線方程y=0.274x+0.985求得白藜蘆醇與CTD N A的結(jié)合常數(shù)K=2.75×105。

3.3.2 粘度法研究白藜蘆醇與CT-DNA的相互作用 隨著白藜蘆醇濃度的增加，DNA溶液的粘度逐漸增加。以η1/3對結(jié)合比率[白藜蘆醇]/[CT-DNA]作圖（附圖7），R2=0.9918。一般來講，當(dāng)小分子配體以插入方式與DNA相互作用時，DNA相鄰堿基對的距離會變大以更好地容納配體分子，這就會導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)伸長，DNA溶液粘度增加；當(dāng)小分子配體與DNA為靜電作用或溝槽結(jié)合時，DNA溶液粘度無明顯變化；當(dāng)小分子配體以部分插入方式與DNA作用時，可能使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)紐結(jié)，使其粘度增加[12][13][14]。由此推斷，白藜蘆醇與CT-DNA的結(jié)合模式為插入或部分插入。小分子藥物與DNA嵌插結(jié)合時，會使DNA相鄰堿基對的距離變大及整個DNA雙螺旋鏈增長，從而導(dǎo)致溶液的黏度增大[15]。

3.3.3 分子對接法研究白藜蘆醇與CTDNA的相互作用 白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)式如附圖8A。阿霉素能嵌插到DNA的C-G堿基對中，與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，活性口袋如附圖8B。從附圖8C可以看出，白藜蘆醇以平行于堿基對的方式對接插入CT-DNA。從附圖8D可以看出，白藜蘆醇分子中與兩個羥基相連的苯環(huán)與胞嘧啶脫氧核糖核苷酸中堿基的嘧啶環(huán)和鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸中堿基的嘌呤環(huán)通過π-π堆疊的疏水鍵連接，且白藜蘆醇分子上的C3-OH與嘌呤環(huán)上的酮基氧原子形成氫鍵。白藜蘆醇與CT-DNA(1NAB)結(jié)合能-27.25kcal/mol。據(jù)此推斷，白藜蘆醇分子與CT-DNA的相互作用模式可能為嵌插作用。

4 討論

癌癥屬于多發(fā)性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。2019年國家癌癥中心發(fā)布的全國癌癥報告顯示，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅中國人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，占居民全部死因的23.91%，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費超過2200億，防控形勢嚴(yán)峻。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，人們從中藥中不斷發(fā)現(xiàn)抗腫瘤有效成分。近年來大量研究表明虎杖及其白藜蘆醇等活性成分具有良好的抗腫瘤活性[16]。國內(nèi)外對白藜蘆醇藥理作用及作用機制進(jìn)行了有價值的探索，取得了鼓舞人心的結(jié)果。

本文首先評價白藜蘆醇對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，采用MTT法比較其體外抗人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞LO2增殖活性，結(jié)果表明，白藜蘆醇可明顯抑制BXPC-3細(xì)胞增殖，且此抑制作用呈濃度依賴性，而對于LO2細(xì)胞幾乎無影響。由此可見，白藜蘆醇對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定選擇性。在此基礎(chǔ)上，本文繼續(xù)研究白藜蘆醇對人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞周期分布及凋亡情況的影響，與對照組相比，白藜蘆醇處理組BXPC-3G0/G1期細(xì)胞比例明顯提高，G2/M期細(xì)胞比例明顯降低，說明白藜蘆醇可能在G0/G1期阻滯BXPC-3細(xì)胞增殖。流式檢測結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用組與對照組相比，BXPC-3細(xì)胞凋亡比例顯著增加。因此，白藜蘆醇可促進(jìn)人胰腺癌BXPC-3 細(xì)胞凋亡。

在分子層面，本文采用紫外吸收光譜、粘度法、分子對接探索了白藜蘆醇與CT-DNA的相互作用模式。紫外吸收光譜實驗結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加，CT-DNA溶液的吸收峰不改變，吸光度遞減。由此推斷，白藜蘆醇與CT-DNA的結(jié)合模式可能為嵌插。粘度實驗結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加，CT-DNA溶液的粘度逐漸增加，并且η1/3與[白藜蘆醇]/[CT-DNA]呈線性關(guān)系，白藜蘆醇與CT-DNA可能的結(jié)合模式為嵌插。分子對接結(jié)果也提示白藜蘆醇與CT-DNA最可能的相互作用模式為嵌插作用。

綜上分析，白藜蘆醇可能在人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞周期的G0/G1期阻滯細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，也可能通過插入CTDNA的堿基對與CT-DNA相互作用，從而影響CT-DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，因而表現(xiàn)出抗人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞增殖活性。

5 致謝

感謝“基礎(chǔ)與專業(yè)藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心（首都醫(yī)科大學(xué)）”和“醫(yī)學(xué)化學(xué)與藥學(xué)北京高等學(xué)校示范性校內(nèi)創(chuàng)新實踐基地（首都醫(yī)科大學(xué)）”兩大平臺的支持。感謝國家級虛擬仿真實驗項目、內(nèi)源式預(yù)防藥物教育部工程研究中心和多肽及小分子藥物北京市重點實驗室的支持。感謝2020年北京高等學(xué)校高水平人才交叉培養(yǎng)“實培計劃”、首都醫(yī)科大學(xué)本科生科研訓(xùn)練項目（XSKY2020）的支持。