中藥注射液“Q-Markers”的辨析研究＊—丹紅注射液研究實例

楊 靜，江振作，柴 欣，王 毅，趙步長，趙筱萍，王躍飛＊＊

（1. 天津中醫(yī)藥大學天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室 天津 300193；2. 浙江大學中藥科學與工程學系杭州 310058；3. 山東丹紅制藥有限公司 菏澤 274000；4. 浙江中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 杭州 310053）

中藥注射液“Q-Markers”的辨析研究＊—丹紅注射液研究實例

楊 靜1，江振作1，柴 欣1，王 毅2，趙步長3，趙筱萍4，王躍飛1＊＊

（1. 天津中醫(yī)藥大學天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室 天津 300193；2. 浙江大學中藥科學與工程學系杭州 310058；3. 山東丹紅制藥有限公司 菏澤 274000；4. 浙江中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 杭州 310053）

中藥質(zhì)量控制是保證中藥臨床用藥安全性和有效性的重要措施，也是制約中藥現(xiàn)代化進程的重要因素。由于中藥的復雜性，目前的中藥質(zhì)量標準研究仍比較薄弱。構(gòu)建符合中藥特點的質(zhì)量控制體系，是當前中藥現(xiàn)代化進程中亟待解決的難題。本文以丹紅注射液為例，從化學物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量標志物、質(zhì)控方法3個層次，闡述中藥注射液“Q-Markers”辨析策略，為中藥質(zhì)量控制研究提供新思路。

質(zhì)量標志物 質(zhì)量控制 中藥注射液

中藥質(zhì)量標志物（Q-marker）存在于中藥材及其相關(guān)產(chǎn)品（如中藥飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑），是藥材固有的或加工、制備過程中形成的，且與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學物質(zhì)，因其是反映中藥安全性、有效性的標志性物質(zhì)，在研究中需要對其進行質(zhì)量控制[1]。中藥質(zhì)量控制是中藥臨床用藥安全、有效的基礎(chǔ)和保障，Q-marker是中藥質(zhì)量控制的核心，對它的辨析研究是“深入”研究、“淺出”標準系統(tǒng)研究工程的重要組成部分。近年來，自劉昌孝院士提出“中藥質(zhì)量標志物”這一新概念后，國內(nèi)知名的專家、學者提出了一些研究思路和方法。張鐵軍等[2，3]提出基于“性-效-物”三元論的基本認識，建立中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制及質(zhì)量標志物的研究策略和研究模式，確定了延胡索甲素、延胡索乙素、原阿片堿、歐前胡素、異歐前胡素為元胡止痛滴丸的質(zhì)量標志物。孫蓉等[4]提出基于“效-毒”關(guān)聯(lián)評價的 Q-marker的辨析技術(shù)，確定了吳茱萸中4個代表性化合物吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿、β-蒎烯為質(zhì)量標志物，其體現(xiàn)了吳茱萸質(zhì)量標志物對“效-毒”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的“多組分、多靶點、多途徑”的作用機制。熊亮等[5]基于化學物質(zhì)基礎(chǔ)研究、化學成分專屬性研究、化學結(jié)構(gòu)和生物活性研究、可測性研究、指紋圖譜研究辨析了益母草和趕黃草的質(zhì)量標志物。

本研究以丹紅注射液為例，研究構(gòu)建中藥注射液化學物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量標志物、質(zhì)控方法的質(zhì)量控制研究模式。圍繞中藥注射液中化學物質(zhì)基礎(chǔ)的問題，采用定量核磁共振技術(shù)、UPLC-UV、火焰原子吸收分光光度法分別對丹紅注射液中氨基酸、單糖、小分子有機酸，酚酸、核苷、黃酮，鈉、鉀離子進行了分析，已知化合物占總固體量的60%以上；圍繞中藥注射液質(zhì)量標志物的問題，構(gòu)建了“蛛網(wǎng)模式”辨析丹紅注射液中的“Q-markers”的方法；圍繞中藥注射液質(zhì)控方法的問題，構(gòu)建了指標成分分析和活性評價相結(jié)合的雙標準質(zhì)量評價方法，并結(jié)合指紋圖譜技術(shù)綜合評價丹紅注射液的質(zhì)量。本研究可以為構(gòu)建符合中藥特點的中藥注射液質(zhì)量控制模式提供了有益的借鑒。

1 化學物質(zhì)基礎(chǔ)

中藥化學物質(zhì)基礎(chǔ)研究是認識和研究中藥的基石，也是深入研究中藥作用機制的關(guān)鍵步驟。系統(tǒng)闡釋中藥的化學物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于進一步開展深入研究。然而，中藥成分復雜、各成分理化性質(zhì)差異較大，單一檢測技術(shù)難以全面表征中藥的全部化學成分。為此，需借助多種分析技術(shù)，整合分析多種檢測結(jié)果，進而系統(tǒng)表征中藥的化學成分。根據(jù)丹紅注射液的特點，本課題組基于核磁共振波譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、火焰原子吸收分光光度法，解析了其中60%（質(zhì)量占比）的化學成分，具體分析策略如圖1所示。

本課題組建立了一種無偏向性、簡單快速、準確的質(zhì)子核磁共振指紋圖譜方法，用于丹紅注射液中多酚酸類成分（丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛）和氨基酸、糖類、有機酸類成分（纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、焦谷氨酸、天門冬氨酸、果糖、葡萄糖、蕓香糖、琥珀酸、丙二酸）的定性及定量研究[6]。該方法通過25批次丹紅注射液的成分檢測與分析，同時測定其中13個主要化合物，并結(jié)合多元統(tǒng)計模型，可以發(fā)現(xiàn)過期的丹紅注射液樣品。

基于UPLC-DAD/ESI-Q-TOF MS技術(shù)，本課題組共鑒定了丹紅注射液中的21個化合物，它們主要為核苷、黃酮、酚酸類成分[7]。進一步的研究中，我們采用基于波長切換技術(shù)的UPLC-UV法同時測定10批次丹紅注射液中16個成分（胞苷、尿苷、腺苷、苯丙氨酸、5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、紫丁香苷、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C）的含量[8]。

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版規(guī)定，靜脈注射液必須開展鉀離子的限度檢查[9]。結(jié)合鈉離子在調(diào)節(jié)人體細胞和血液滲透壓的作用，本課題組開展了基于火焰原子吸收分光光度法測定丹紅注射液中鈉、鉀離子含量的方法，樣品經(jīng)微波消解系統(tǒng)消解后，采以氯化銫為電離抑制劑，分別于589.0 nm和766.9 nm處測定丹紅注射液中鈉、鉀離子的含量[10]。

圖1 中藥注射液化學物質(zhì)研究策略

2 質(zhì)量標志物

在系統(tǒng)闡釋丹紅注射液的化學物質(zhì)基礎(chǔ)上，辨析丹紅注射液的質(zhì)量標志物，即解決質(zhì)量標志物的難題。中藥注射液化學成分復雜，全面監(jiān)控所有成分不僅滿足不了實際需求，也增加了監(jiān)控難度。而且，對無效成分監(jiān)控不僅增加成本、浪費資源，還可能影響對中藥注射液質(zhì)量的判斷。因此，需要從復雜的成分中摒棄無效、干擾成分，遴選關(guān)鍵的或核心的質(zhì)量標志物。這種物質(zhì)既能代表中藥注射液的藥效，又能反映中藥注射液的內(nèi)在質(zhì)量，是質(zhì)量控制的關(guān)鍵，也是質(zhì)量標志物優(yōu)選的關(guān)鍵。為辨析丹紅注射液的質(zhì)量標志物，本課題組提出了“蛛網(wǎng)模式”辨析質(zhì)量標志物的方法。丹紅注射液的質(zhì)量標志物需滿足以下3個條件：①中藥注射液代表性成分；②具有制劑條件下較好的穩(wěn)定性；③具有與藥物疾病治療作用相關(guān)的活性。具體的技術(shù)路線如圖2所示。

根據(jù)丹紅注射液特點，以胞苷、尿苷、腺苷、苯丙氨酸、5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、紫丁香苷、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C為候選化合物，從3個方面（活性、含量、穩(wěn)定性）、5個維度（抗氧化活性、抗血小板活性、含量、高溫穩(wěn)定性、強光穩(wěn)定性）綜合辨析丹紅注射液“Q-markers”。以化合物各維度得分連線所得的面積（多元網(wǎng)絡(luò)回歸面積）作為“Q-markers”的選擇依據(jù)?；衔锏幕貧w面積越大，即表明該成分的“Q-markers”屬性越好，綜合貢獻越大，為首選的“Q-markers”；反之，化合物的回歸面積越小，即說明該成分在丹紅注射液中的綜合貢獻越小，應作為備選“Q-markers”或者不選。

圖2 基于“蛛網(wǎng)模式”辨析丹紅注射液“Q-markers”的技術(shù)路線

圖3 原位定點TLC-DPPH生物自顯影法

2.1 抗氧化活性維度

本課題組構(gòu)建了原位定點TLC-DPPH生物自顯影法，用以快速篩選丹紅注射液中抗氧化活性成分[8]（圖3）。以維生素C為陽性對照，將測試化合物點樣于薄層板上，噴0.1%DPPH無水乙醇溶液顯色，在紫色背景下具有DPPH?清除活性的化合物為淡黃白色斑點，斑點亮度強弱顯示樣品DPPH?清除活性的強弱。在此基礎(chǔ)上，采用DPPH微孔定量測定法測定并繪制具有DPPH?清除活性化合物的S型劑量-效應曲線，獲得丹酚酸B、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸C、咖啡酸、丹酚酸A、迷迭香酸、紫草酸、丹參素的IC50值。將各成分IC50值的倒數(shù)除以其中的最大值進行數(shù)據(jù)歸一化處理，計算結(jié)果作為“抗氧化活性維度”，計算公式如下：

2.2 抗血小板活性維度

構(gòu)建基于微孔板的抗血小板聚集活性研究方法，以健康志愿者的重懸血小板為篩選模型，以血栓烷A2類似物U46619為激動劑，篩選16個候選化合物的抗血小板聚集活性并獲得活性化合物（丹酚酸A、丹酚酸B）的IC50值。將各成分IC50值的倒數(shù)除以其中的最大值進行數(shù)據(jù)歸一化處理，計算結(jié)果作為“抗血小板聚集活性維度”，計算公式如下：

2.3 含量維度

根據(jù)10個批次丹紅注射液中16個候選成分的含量測定結(jié)果[8]，分別計算10批丹紅注射液16個候選成分的平均值（C-n），該值反映各成分在丹紅注射液中的含量高低。將各成分平均含量除以其中成分平均含量的最大值（Cmax）進行數(shù)據(jù)歸一化處理，作為“含量維度”，計算公式如下：

2.4 高溫穩(wěn)定性、強光穩(wěn)定性維度

根據(jù)丹紅注射液特點，本課題組系統(tǒng)考察了丹紅注射液中16個候選化合物的高溫、強光穩(wěn)定性[11]。將丹紅注射液置于恒溫恒濕箱中，分別于60 ℃（避光）、強光（4 500±500 lx）條件下放置10天。于第5天和第10天取樣分析，研究高溫、強光對丹紅注射液中候選成分的影響。計算16個候選成分相對于0天含量測定結(jié)果的比值減100%的絕對值，以表示含量變化的程度，含量變化越大，穩(wěn)定性越差；再用1減去該絕對值，使計算結(jié)果與穩(wěn)定性正相關(guān)，得到“高溫或強光穩(wěn)定性維度”，計算公式如下：

高溫或強光穩(wěn)定性維度=1-|CRn-100%|

其中，CR為丹紅注射液在高溫或強光條件下放置10天的候選成分的含量相對于0天含量的比值；n為候選化合物1-16。

圖4 丹紅注射液16個候選成分抗氧化活性、抗血小板聚集活性、含量、高溫穩(wěn)定性、強光穩(wěn)定性數(shù)據(jù)歸一化結(jié)果

圖5 基于“蛛網(wǎng)模式”的丹紅注射液“Q-Marker”辨析研究

綜合上述結(jié)果，得到丹紅注射液16個候選成分抗氧化活性、抗血小板聚集活性、含量、高溫穩(wěn)定性、強光穩(wěn)定性5個維度的數(shù)據(jù)歸一化結(jié)果（圖4），進一

步構(gòu)建“蛛網(wǎng)模式”圖用于辨析丹紅注射液的質(zhì)量標志物（圖5）。綜合分析可知，丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A、原兒茶酸、迷迭香酸等成分是丹紅注射液優(yōu)選的質(zhì)量標志物。

圖6 丹紅注射液指紋圖譜研究

3 質(zhì)量控制方法

本研究通過“蛛網(wǎng)模式”分析方法，系統(tǒng)辨析并獲得了丹紅注射液“Q-markers”。結(jié)合中藥注射液的特點并考慮質(zhì)量控制方法的適用性，課題組提出了“指標成分測定-活性評價相結(jié)合的雙標準質(zhì)量控制研究”與“指紋圖譜研究”相結(jié)合的中藥注射液質(zhì)量控制方法，以科學、全面地評價中藥注射液的質(zhì)量。

3.1 雙標準質(zhì)量控制研究

中藥有別于化藥和生物制劑，簡單的化學或生物評價模式均無法全面反映中藥的復雜性和整體性。中藥注射液化學成分復雜，應該從“宏觀”控制中藥注射液的整體活性，從“微觀”控制“Q-markers”或指標成分的含量，基于“整體活性評價”和“Q-markers或指標成分測定”，構(gòu)建雙標準質(zhì)量評價體系（Dual-Standard Quality Assessment System，DSQAS）[8]。采用DPPH微孔定量測定法測定丹紅注射液清除DPPH自由基的活性，構(gòu)建了丹紅注射液DPPH自由基清除活性的標準；采用UPLC-UV法構(gòu)建了指標成分的含量測定方法及標準，并且基于“Q-markers”辨析結(jié)果，進一步建立了丹紅注射液的“Q-markers”的含量測定方法及標準。因此，建立以DPPH自由基清除活性評價中藥注射液的整理活性，以指標成分或“Q-markers”測定成分的含量，構(gòu)建“宏觀”和“微觀”控制相結(jié)合的雙標準質(zhì)量控制方法，實現(xiàn)對中藥注射液的質(zhì)量控制。

3.2 指紋圖譜研究

基于指標成分測定的中藥質(zhì)量控制方法，只控制中藥中的部分成分，忽略了中藥中的成分多樣性、多種機制的協(xié)同作用，難以全面衡量中藥的療效和質(zhì)量[12，13]。中藥指紋圖譜（Fingerprints of Traditional Chinese Medicine）指采用一定的分析手段，得到能夠標示中藥特性的共有峰的圖譜[14]。因其整體性、模糊性的特點，被廣泛用于評價中藥質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性研究[15]。本課題組在構(gòu)建的雙標準質(zhì)量控制方法的基礎(chǔ)上，亦構(gòu)建了丹紅注射液指紋圖譜[7]，共指認了24個共有峰，鑒定了丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A、丹酚酸A、丹酚酸B等21個成分，實現(xiàn)丹紅注射液的全面質(zhì)量控制（圖6）。

4 總結(jié)與展望

本文以丹紅注射液研究為例，從化學物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量標志物、質(zhì)控方法三個層次，闡述了丹紅注射液“Q-Markers”的辨析技術(shù)。通過多種分析方法，闡釋丹紅注射液的化學物質(zhì)；綜合利用活性評價、穩(wěn)定性研究、含量測定研究等多種方法構(gòu)建了“蛛網(wǎng)模式”辨析丹紅注射液的“Q-Markers”；建立活性評價和指標成分定量相結(jié)合的質(zhì)量評價方法，并結(jié)合指紋圖譜研究全面評價其質(zhì)量。

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Discriminant Analysis of “Q-Markers” of Traditional Chinese Medical Injections—Taking Dan Hong Injection as a Model

Yang Jing1, Jiang Zhenzuo1, Chai Xin1, Wang Yi2, Zhao Buchang3, Zhao Xiaoping4, Wang Yuefei1
(1. Tianjin State Laboratory of Modern Chinese Medicine, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2. Department of Chinese Medicine Science & Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 3. Shandong Danhong Pharmaceutical Co., Ltd., Heze 274000, China; 4. College of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Quality control of traditional Chinese medicine is of great importance to ensure its safety and effectiveness in clinic, and is also an obstacle impeding the modernization of traditional Chinese medicine. Though, the complexity of traditional Chinese medicine resulted in some relative weakness of quality standard researches. The critical point need addressing is to establish a sound quality standard system conforming to the characteristics of traditional Chinese medicine in the process of the modernization of Chinese medicine. In this paper, in regard to Dan Hong injection, discriminant strategy of “Q-Markers” from traditional Chinese medicine injection was clarified from three aspects: what ingredients, which to control and how to control, providing a new vision in the field of the quality standard researches of traditional Chinese medicine.

Quality-markers, quality control, traditional Chinese medical injection

10.11842/wst.2016.12.005

R288

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-12-20

修回日期：2016-12-20

＊ 國家自然科學基金項目（81503239）：中藥注射劑（丹紅注射液）“量-穩(wěn)-活-代”多維“質(zhì)控markers”的辨析研究，負責人：楊靜。

＊＊ 通訊作者：王躍飛，博士，副研究員，主要研究方向：中藥質(zhì)量控制及腸道微生態(tài)研究。