紅葉石楠離體快繁體系的建立

錢(qián)晶晶， 周玉麗， 吳 燕， 江文林， 張香楊， 張遠(yuǎn)兵*

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.潤(rùn)林建設(shè)有限公司，安徽 滁州 239000)

紅葉石楠(PhotiniafraseriDress)是薔薇科石楠屬植物，分布廣泛[1]。因其新稍為亮紅色，具有較高的觀賞價(jià)值，所以經(jīng)常作為園林植物應(yīng)用于道路綠化、園區(qū)美化等方面[2]。該樹(shù)耐鹽堿性及耐旱能力較強(qiáng)，適合在土壤貧瘠的地區(qū)種植，生長(zhǎng)速度快及管理方法簡(jiǎn)單，在我省極具推廣價(jià)值和前景[3-4]。但目前紅葉石楠的繁殖主要依靠扦插，這種方法受到土地、環(huán)境和氣候等外界因素制約較多，導(dǎo)致其繁育較慢[5-6]，尤其是占用土地資源較多，也影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用地。另外扦插繁殖所帶來(lái)的品種退化，植物壽命短等問(wèn)題也越來(lái)越凸顯，因而發(fā)展一種現(xiàn)代繁育技術(shù)培育紅葉石楠種苗，成為目前的當(dāng)務(wù)之急。組織培養(yǎng)可以通過(guò)植物的一部分組織或細(xì)胞成功的“克隆”出一個(gè)完整的植物，也可以縮短植物的繁殖周期。組織培養(yǎng)環(huán)境是一個(gè)相對(duì)封閉、統(tǒng)一的人工環(huán)境[7-9]。避免了外界的光、水、養(yǎng)分和菌落的差異，統(tǒng)一了植物的培養(yǎng)環(huán)境，避免外界干擾，有利于培養(yǎng)高質(zhì)量的紅葉石楠無(wú)性繁殖苗，提高紅葉石楠種苗的質(zhì)量。

本試驗(yàn)通過(guò)組織培養(yǎng)的方法，獲得可以移栽的紅葉石楠離體快繁苗，從而建立紅葉石楠的快速繁殖體系，以解決其扦插繁殖品種退化以及受季節(jié)、土地限制等問(wèn)題，為紅葉石楠的現(xiàn)代化大規(guī)模繁育優(yōu)質(zhì)種苗提供參考。

1 材料方法

1.1 供試材料

外植體來(lái)源于安徽科技學(xué)院種植基地，采集健壯的無(wú)病蟲(chóng)害紅葉石楠新生嫩莖，去除葉片作為外植體，用流水沖洗10 min，采用赤霉素浸泡30 min后備用。

培養(yǎng)室培養(yǎng)條件：光照為2 400 LX，溫度為25±1 ℃，光照時(shí)間為12 h/d，相對(duì)濕度為60%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 取紅葉石楠莖尖(紅葉石楠尖端1 cm嫩芽)，清水沖洗10 min，再放入70%乙醇浸泡30 s，放入超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌水沖洗3次，分別用消毒劑進(jìn)行消毒處理(消毒劑及處理時(shí)間見(jiàn)表1)，再用無(wú)菌水沖洗5次，最后將沖洗好的材料放于濾紙上備用。

1.2.2 外植體接種 在解剖鏡下，用解剖針將外植體莖尖苞片逐層撥開(kāi)，直到只剩下葉原基生長(zhǎng)點(diǎn)，直徑約為0.3～0.5 mm。用手術(shù)刀切下生長(zhǎng)點(diǎn)接種于培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。35 d后統(tǒng)計(jì)污染狀況和成活狀況。污染率=(污染植株/接種數(shù))×100%，成活率=(成活數(shù)/未污染數(shù))×100%。比較不同消毒劑及消毒時(shí)處理對(duì)紅葉石楠莖尖生長(zhǎng)的影響，每個(gè)處理進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，每組10 顆植株進(jìn)行試驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù),并計(jì)算平均數(shù)。

表1 不同消毒劑及消毒時(shí)間

1.2.3 不定芽分化及生根培養(yǎng) 接種45 d當(dāng)成活外植體長(zhǎng)到0.5 cm左右時(shí)取出，接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35 d，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)狀況，分化率=(分化不定芽數(shù)/接種數(shù))×100%，生根=(生根組培苗數(shù)/接種數(shù))×100%。試驗(yàn)采取三因素五水平正交設(shè)計(jì)，比較不同激素及濃度處理對(duì)紅葉石楠組培苗分化及生根的影響，共25組(表2)。

試驗(yàn)中，以不加激素處理為對(duì)照。每個(gè)處理進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，每組10顆植株進(jìn)行試驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)計(jì)算平均數(shù)。

表2 不同激素及濃度處理組合

1.2.4 煉苗 將生根健壯的組培苗打開(kāi)組培瓶蓋，進(jìn)行煉苗5 d。煉苗室環(huán)境為溫度25±1 ℃，光照時(shí)間 12 h/d，相對(duì)濕度60%～65%。統(tǒng)計(jì)成活=(成活數(shù)/總煉苗數(shù))×100%。比較不同光照強(qiáng)度(1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 LX)對(duì)紅葉石楠煉苗成活率影響。每個(gè)光照強(qiáng)度為一個(gè)處理，每個(gè)處理100顆植株，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 移栽 煉苗后，挑選健壯幼苗洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)育苗盤(pán)中，放置于溫室中，光照為自然光照，每日早晚于葉片上噴水，保持葉面及土壤濕潤(rùn)，每隔兩周?chē)娛┫♂?0倍MS工作液。30 d后比較不同濕度(50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)紅葉石楠移栽苗成活率影響。每個(gè)梯度濕度為一個(gè)處理，每個(gè)處理50顆植株，記錄數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑及消毒時(shí)間對(duì)紅葉石楠莖尖接種的影響

紅葉石楠莖尖接種后，5～7 d內(nèi)開(kāi)始返青。接種15 d能看到明顯的芽點(diǎn)分化，45 d時(shí)莖尖完全分化為紅葉石楠組培苗，此時(shí)苗高達(dá)到0.5 cm以上即可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖1)。

圖1 紅葉石楠生長(zhǎng)離體快繁接種后生長(zhǎng)狀態(tài)

從表3可以看出，5% NaClO消毒20 min以上和HgCl2的消毒8 min以上時(shí)污染率明顯低于其他處理污染率，可降至16.7%甚至更低。但是NaClO處理過(guò)后的紅葉石楠莖尖明顯出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象。HgCl2處理時(shí)間超過(guò)8 min，雖然沒(méi)有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但是莖尖活力明顯降低，接種35 d后莖尖返青率從8 min的76.7%迅速降到消毒14 min的46.7%。因此，在外植體的最佳消毒方案為0.1% HgCl2消毒8 min。

表3 不同消毒劑及消毒時(shí)間對(duì)紅葉石楠莖尖接種的影響

2.2 不同激素及濃度組合對(duì)紅葉石楠不定芽分化的影響

從表4可以看出，第11、16、23組誘導(dǎo)不定芽分化效果較好。激素組合中顯示：6-BA對(duì)紅葉石楠組培苗不定芽起到較好誘導(dǎo)作用，當(dāng)6-BA濃度高于1.0 mg/L誘導(dǎo)出不定芽也較多，但是當(dāng)6-BA濃度過(guò)高達(dá)到2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出的不定芽莖細(xì)，葉片小，繼代后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象(第23組)。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，KT的存在對(duì)誘導(dǎo)出不定芽分化有較為明顯的促進(jìn)作用，KT高于0.4 mg/L時(shí)誘導(dǎo)出的不定芽較為粗壯，更適合繼代、不定芽分化及生根等。

因而最適合紅葉石楠不定芽分化培養(yǎng)基為：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT，使用該培養(yǎng)基對(duì)紅葉石楠組培苗進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，分化率能夠達(dá)到100%，每株組培苗可以誘導(dǎo)出分化不定芽7.1±1.08 棵，分化出的不定芽平均高度為1.99±0.153 cm，較為健壯適合后續(xù)培養(yǎng)(圖2A)。

圖2 不同激素處理下紅葉石楠生長(zhǎng)狀況

表4 不同激素及濃度組合對(duì)紅葉石楠組培苗生長(zhǎng)的影響

2.3 不同激素及濃度組合對(duì)紅葉石楠組培苗生根的影響

本試驗(yàn)紅葉石楠最優(yōu)生根培養(yǎng)基為第19組：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.9 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。該條件下培養(yǎng)35 d后誘導(dǎo)生根率可達(dá)到100%，培養(yǎng)每棵組培苗平均生根數(shù)為14.9±2.42，根紅褐色、粗壯，平均根長(zhǎng)8.47±0.959 cm。苗高5.36±0.148 cm，莖粗，非常適合移栽(圖2B)。值得注意的是，對(duì)照組(第1組)在各個(gè)激素為零的情況下，也出現(xiàn)了部分組培苗生根情況，說(shuō)明該植株較易生根，添加NAA濃度為0.3 mg/L時(shí)就出現(xiàn)紅葉組培苗在分生不定芽的同時(shí)有70.0%±0.10%的組培苗誘導(dǎo)生根的現(xiàn)象(第17組)。但是紅葉石楠組培苗生根水平并不是隨著NAA的生根而持續(xù)升高，在NAA濃度為1.2 mg/L時(shí)(第10組和第25組)，其生根率和生根數(shù)都出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。因而，本試驗(yàn)中紅葉石楠生根培養(yǎng)中NAA最適添加濃度為0.9 mg/L。

2.4 煉苗移栽

選取粗壯的紅葉石楠組培苗進(jìn)行煉苗及移栽試驗(yàn)。煉苗中，光照強(qiáng)度直接影響到組培苗的存活率，在光照強(qiáng)度低的情況下煉苗5 d，紅葉石楠組培苗存活率最高，光照強(qiáng)度達(dá)到2 000 LX時(shí)，紅葉石楠組培苗成活率明顯降低僅為45%，且移栽過(guò)程中未出現(xiàn)明顯差異。

表5 不同光照條件下煉苗5 d紅葉石楠組培苗存活率

空氣濕度時(shí)影響紅葉石楠組培苗移栽成活率的重要因素，表6顯示，在移栽溫室空氣濕度為70%，移栽成活率可達(dá)99%，是最為理想的移栽條件。移栽30 d后的紅葉石楠葉片生長(zhǎng)加快、莖節(jié)短、腋芽開(kāi)始萌發(fā)、根部逐漸變黑、生長(zhǎng)明顯、長(zhǎng)勢(shì)佳(圖3C)，符合工廠化育苗要求。

表6 不同空氣濕度條件下紅葉石楠移栽成活率

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從消毒劑種類(lèi)、激素添加量等對(duì)紅葉石楠組織培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行篩選：(1)外植體的最佳消毒方案為：0.1% HgCl2消毒8 min；(2)不定芽分化最佳培養(yǎng)基為：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT；(3)紅葉石楠最優(yōu)生根培養(yǎng)基為：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.9 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。避免了近年來(lái)關(guān)于紅葉石楠的組織培養(yǎng)研究中研究不系統(tǒng)等[10-13]問(wèn)題。其次，關(guān)于紅葉石楠組織培養(yǎng)的研究生中，并未明確煉苗和移栽的研究條件及成活率，使規(guī)?；绲某杀倦y以統(tǒng)計(jì)，不具備生產(chǎn)價(jià)值[14]。本試驗(yàn)從煉苗和移栽主要條件進(jìn)行篩選出移栽苗最大成活率，試驗(yàn)顯示1 000 LX強(qiáng)度下煉苗5 d后。放置于溫室中，光照為自然光照，每日早晚于葉片上噴水，保持葉面及土壤濕潤(rùn)，每隔兩周?chē)娛┫♂?0倍MS工作液，在空氣濕度70%的條件下，移栽苗成活率達(dá)到99%，適合紅葉石楠大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。多數(shù)研究文章選取腋芽或莖段作為外植體，使得外植體取樣時(shí)間多在早春中進(jìn)行，范圍較為窄小[15]。另外，本試驗(yàn)采取紅葉石楠莖尖作為材料進(jìn)行外植體接種，由于紅葉石楠自身生長(zhǎng)特性，使接種時(shí)間擴(kuò)大到4至11月份，隨時(shí)取樣、隨時(shí)接種，擴(kuò)展了接種時(shí)間。最后，本試驗(yàn)通過(guò)莖尖剝離的方法對(duì)紅葉石楠進(jìn)行離體快繁處理，使紅葉石楠苗更加健壯，解決了傳統(tǒng)扦插繁殖紅葉石楠品種退化、植株老株病株多等問(wèn)題。