突破光學衍射極限：實現(xiàn)遠場納米級分辨的光學顯微鏡

倪潔蕾　程亞

由于光學衍射極限，遠場光學顯微鏡的分辨率僅能達到光波長的一半左右。在可見光波段，這一極限大約為200納米。而對于生命科學研究，往往需要數(shù)十納米甚至更高的分辨率，以獲取組織或活細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的信息。2014年度的諾貝爾化學獎獲得者解決了這一世紀難題。

2014年度的諾貝爾化學獎授予在超分辨光學顯微鏡領域做出開創(chuàng)性貢獻的三位科學家：貝齊格（E.Betzig）、黑爾（S.W.Hell）和莫納（W.E.Moerner）。對于很多同行而言，這件事既在意料之中，卻也頗顯意外。

西方人有一句諺語：“Seeing is believing（眼見為實）?！币虼?，成像與觀測領域的重大突破一直為諾貝爾獎所青睞。300余年前，當荷蘭科學家列文虎克（A.van Leeuwenhoek）利用自己搭建的顯微鏡觀察水珠時，他意外地發(fā)現(xiàn)了懸浮在水滴中的細小浮游微生物，從此向世人打開了進入微觀世界的大門。從幾何光學角度看，通過合理設計光學成像系統(tǒng)，光學顯微鏡具備實現(xiàn)任意放大倍率的能力。然而，人們身處的世界在本質(zhì)上是量子世界，最終一切物質(zhì)都必須用“波”的概念來描述，對光自然也不例外。因此，當人們利用光波來進行顯微觀測時，量子力學中的不確定性原理為光學顯微鏡的分辨率設置了一道屏障，即光學衍射極限。

自從1873年德國科學家阿貝（E.Abbe）首次提出光學衍射極限的概念開始，直到20世紀末，人們一直認為光學顯微鏡所能夠看清的物體的最小尺寸大約為光波長的一半左右（對于可見光而言，這一極限尺寸大約在200納米）。這意味著科學家們可以辨別完整細胞，以及其中一些被稱為細胞器的組成部分。然而，他們卻無法分辨一個正常大小的病毒或者單個蛋白質(zhì)。在這樣的背景下，即便對于很多一流的光學科學家，他們也已形成了一個思維定勢，認為突破光學衍射極限在理論上是一件不可能的事情。正是得益于今年的諾貝爾化學獎獲獎者提出的開創(chuàng)性成像新概念，這一狀況才得以被奇跡般地終結(jié)。

值得注意的是，阿貝的光學衍射極限概念是基于光波自身的波動本性所得到的，而當代很多的先進光學顯微技術往往借助于光與物質(zhì)相互作用中產(chǎn)生的各種奇特效應來實現(xiàn)，這為突破光學衍射極限打開了缺口。迄今為止，成功實現(xiàn)超分辨的途徑可以分成兩類。一類是對激發(fā)光進行整形，再結(jié)合材料對光的非線性響應來減小光斑，例如受激發(fā)射損耗方法（stimulated-emission-depletion，STED）和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（structured illumination microscopy，SIM）；另一類就是借助單分子成像技術，光激活定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM）和隨機光學重建顯微技術（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）是其中的代表。

受激發(fā)射損耗

黑爾自1990年在海德堡大學獲博士學位后，就一直在尋找突破衍射極限難題的方法。1994年，黑爾發(fā)表了一篇論文闡述了利用受激發(fā)射來操控熒光分子的想法。在他設想的技術方案中，顯微鏡（也稱STED顯微鏡）利用熒光分子作為成像對象的標記物。熒光分子的特性是可以被一束波長較短（即光子能量較高）的光束激發(fā)，然后發(fā)射出波長較長的熒光。正如人們感覺黑夜中穿著熒光衣的人特別顯眼，熒光標記使得感興趣的觀測對象在復雜的生物結(jié)構(gòu)中脫穎而出。

黑爾的方法是通過掃描一束激光聚焦焦斑來對樣品進行逐點成像，成像的分辨率取決于焦斑內(nèi)所能夠激發(fā)的熒光分子占據(jù)的體積。因此，為了縮小熒光激發(fā)體積，他采用了兩束組合激光，即一束光被聚焦成正常的衍射極限焦斑，將焦斑內(nèi)的熒光分子抽運到激發(fā)態(tài)；而第二束光則選取在熒光分子的發(fā)射波長范圍，并被聚焦成一個中心與第一束光的焦斑中心完全重合但卻是中空的環(huán)狀焦斑。第二束光可以將被第一束激發(fā)光抽運到激發(fā)態(tài)上去的熒光分子從激發(fā)態(tài)淬滅到基態(tài)，因此也被稱作淬滅光束。由于淬滅光束的光強分布僅在幾何焦點處為零，因此從原理上講，只要淬滅光足夠強，由第一束光激發(fā)的熒光分子所占據(jù)的體積幾乎可以被無限制地壓縮到幾何焦點附近極小范圍內(nèi)。目前，利用該方法可將光學顯微成像的分辨率推進到數(shù)十納米的尺度，遠遠突破了光學衍射極限的限制。相比傳統(tǒng)的共聚焦顯微成像，STED成像技術提供了高得多的光學分辨率，將神經(jīng)元的細節(jié)清晰地顯示出來。

相對于其他光學超分辨成像技術，STED技術最大優(yōu)點是可以較快速地觀察活細胞內(nèi)實時變化過程，這對于生命科學中很多實際問題的研究十分關鍵。2008年，黑爾等人在美國《科學》上發(fā)表文章，報道了以視頻速度（28幀/秒）來采集記錄神經(jīng)細胞內(nèi)突觸小泡的高分辨率圖像（62納米）。2012年，他們又利用STED顯微成像法記錄了活體老鼠腦細胞內(nèi)神經(jīng)細胞間的突觸運動，該項工作有助于理解突觸的運動機制，并可能促進針對突觸內(nèi)的精神治療藥物研究獲得突破。

黑爾是首位不僅從理論上，而且用實驗證明了使用光學顯微鏡能達到納米級分辨率的科學家。但黑爾早期的文章在當時并沒有引起足夠的轟動，即使是非常著名的顯微領域科學家仍然對此抱懷疑態(tài)度。如德國科學家施特爾策（E.H.K.Stelzer）于2002年在英國《自然》上發(fā)表文章，對黑爾發(fā)明的STED技術是否從本質(zhì)上突破了衍射極限表示懷疑。并用堅定的口氣寫道：“眼下有一件事仍然是對的：海森伯（的不確定性原理）是正確的，阿貝極限肯定不會突破。”從這一點上也可以看出，由于100多年光學衍射極限理論的統(tǒng)治地位，人們在思想上已經(jīng)形成了很深的思維定式。

單分子技術與光激活定位顯微鏡

莫納在1989年任職于美國IBM研究中心時，首次在凝聚態(tài)相中實現(xiàn)了單個分子的光吸收測量，這項工作吸引了大量化學家將注意力轉(zhuǎn)向單分子研究。兩年之后，他與另外一個博士后安布羅斯（W.P.Ambrose）利用熒光實現(xiàn)了單分子成像。1997年，他與因綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)而獲2008年諾貝爾化學獎的錢永健合作，發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的光轉(zhuǎn)化效應。這一發(fā)現(xiàn)使得控制熒光探針的發(fā)光成為可能。以光激活熒光蛋白分子為例，當受到波長488納米的光激發(fā)時，該熒光蛋白開始發(fā)出波長更長的綠色熒光，直至被淬滅（淬滅的熒光分子將不再有發(fā)射熒光的能力）。如果此時利用一束405納米的激光照射該熒光蛋白分子，可以將該分子再次激活。激活之后的熒光蛋白如果被488納米的激光照射，又能恢復發(fā)射熒光能力。簡言之，利用488納米和405納米兩種波長的激光，可以交替實現(xiàn)這些熒光蛋白分子的“開”和“關”狀態(tài)。

這一發(fā)現(xiàn)對貝齊格至關重要。貝齊格注意到光學衍射原理雖然不允許人們同時分辨間距小于大約激發(fā)光波長的兩個熒光分子，但一旦兩個分子的間隔增大，從光學上講，它們都分別可以無限高的空間精度被定位。早在1995年，貝齊格就發(fā)表文章提出用不同顏色熒光分子來繞開衍射極限。但由于分子合成與標記等方面的實際操作困難，無法從實驗上加以驗證和實現(xiàn)。2006年，他意識到，其實不需要不同顏色的光，只需借助莫納的單分子技術，讓熒光分子在不同的時間發(fā)光，就可以實現(xiàn)超分辨成像。于是當時賦閑在家的貝齊格和赫斯（H.F.Hess）利用一部在自家客廳組裝的光學顯微鏡搭建出這樣一套顯微系統(tǒng)，稱之為光激活定位顯微鏡（PALM）。他們使用微弱的光脈沖激發(fā)熒光分子，使其中極小部分的熒光分子能夠發(fā)出熒光。因為這些熒光分子很稀疏，相距較遠，所以它們的位置能夠被精確定位。等到這些分子光致褪色后，再繼續(xù)用微弱的光脈沖激活另外一小部分熒光分子，讓它們發(fā)出熒光。通過分別記錄多幅圖像，使不同圖像中的熒光分子所成點像不再相互干擾，從而能夠?qū)γ總€熒光分子逐個進行定位。在全部熒光標記分子的定位完成后，一幅超越衍射極限的圖像即已形成。隨后他們和美國國立衛(wèi)生研究院及佛羅里達州立大學的科學家合作，利用該新技術對生物樣品進行成像，在每平方微米塞滿高達十萬個分子的細胞樣品中，成功分辨出相距僅2～25納米的分子，在細胞片足（lamellipodium）內(nèi)的肌動蛋白（actin）、黏著斑蛋白（vinculin）、細胞膜上的反轉(zhuǎn)錄病毒（retroviral）蛋白Gag等方面取得高清晰成像。

2008年，貝齊格等人將PALM顯微技術應用于活細胞成像來記錄細胞黏附蛋白的動力學過程。2010年，赫斯小組將PALM技術與光的干涉原理結(jié)合起來，發(fā)展成干涉測量光激活定位顯微技術（iPALM），將三維的分辨率提高到20納米以內(nèi)，在納米尺度上觀測到了黏著斑（focal adhesion）的蛋白組織方式，為分析蛋白功能提供了新的信息。

隨機光學重建顯微技術

作為第一位獲美國麥克阿瑟基金會“天才獎”的華人女科學家，莊小威在生物物理顯微成像領域做出了許多重要的成果。幾乎與貝齊格提出PALM概念同時，莊小威也提出了原理相似的隨機光學重建顯微技術（STORM）。STORM與PALM不僅是同年提出，原理也極其相似，都是通過反復激活一猝滅熒光分子，使顯微鏡每次只記錄相距遠的幾個熒光分子，從而對它們進行精確定位，通過光一化學手段，以時間換空間方式獲取了超分辨。與PALM不同的是，莊小威使用的是有機熒光分子對，而非光激活蛋白。他們發(fā)現(xiàn)，不同的波長可以控制化學熒光分子Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色的633納米激光可以激活Cy5發(fā)射熒光，同時長時間照射可以將Cy5分子轉(zhuǎn)換成暗態(tài)不發(fā)光。之后，用綠色的532納米激光照射Cy5分子時，可以將其從暗態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài)，而此過程的長短依賴于第二個熒光分子Cy3與Cy5之間的距離。因此，當Cy3和Cy5交聯(lián)成分子對時，具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā)射波長的特性。

2007年，莊小威研究團隊進一步發(fā)展了多色隨機光學重建顯微方法，并以20～30納米級別的分辨率演示了DNA模式樣品和哺乳動物細胞的多色成像，研究結(jié)果公布在《科學》周刊上。2008年，他們在《科學》周刊上展示了用3D STORM成像技術拍攝的腎細胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)圖和其他的分子結(jié)構(gòu)圖。2011年，莊小威與另一位華人科學家謝曉亮，利用超分辨率熒光顯微鏡對活體大腸桿菌細胞內(nèi)的擬核相關蛋白（NAPs）進行了跟蹤觀察，并由此揭示了細菌遺傳物質(zhì)組織機制。2012年，莊小威小組對STORM進行了改進，通過雙物鏡STORM，在生物成像中獲得了小于10納米的橫向分辨率，以及小于20納米的縱向分辨率。采用這種方法，他們對細胞中的微絲進行了成像，揭示了這種重要細胞骨架的超微結(jié)構(gòu)（微絲是由肌動蛋白組成的直徑約為8納米的纖維結(jié)構(gòu)）。2013年，他們又利用STORM的技術優(yōu)勢，分析了神經(jīng)細胞中肌動蛋白、血影蛋白（spectrin）等相關蛋白的組織結(jié)構(gòu)，提出了關于細胞骨架結(jié)構(gòu)的新假說。

莊小威研究組利用STORM等技術獲得了不少關鍵分子的結(jié)構(gòu)，為超分辨的發(fā)展和推廣應用做出了巨大貢獻。這次她未獲諾貝爾獎，其中的是非曲直，科學界人士各有說法。

結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡

2000年，加利福尼亞大學的物理學家古斯塔夫森（M.Gustafsson）領導的研究團隊開發(fā)出了結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM），并得到了海拉細胞中肌動蛋白細胞骨架的圖像，相比傳統(tǒng)顯微鏡的圖像來說，在橫向上的分辨率提高了2倍。結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡利用調(diào)制光源照明樣品。將原本不可分辨的高分辨率信息編碼入熒光圖像中，結(jié)合計算解碼獲取高分辨率信息，其過程可以通過光學莫爾條紋來理解。莫爾條紋是指由兩種具有精細結(jié)構(gòu)的圖形疊加之后出現(xiàn)的比較粗的干涉條紋。在結(jié)構(gòu)光照明成像中，具有精細結(jié)構(gòu)的樣品和調(diào)制照明光場都有很高的空間頻率，難以直接分辨，但是其疊加產(chǎn)生的粗條紋（莫爾條紋）卻具有很低的空間頻率，可以直接被分辨。由于調(diào)制光場是已知的，通過測量莫爾條紋就可以反推出樣品的精細結(jié)構(gòu)。SIM技術同樣也生成了許多美麗的高清晰細胞圖像。

2005年，古斯塔夫森又利用熒光分子的飽和吸收特性，發(fā)展出飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術（SSIM），將整體分辨率提高了4倍。

結(jié)構(gòu)光學顯微鏡在寬場成像的基礎上提供了一種簡單、具有快速獲取圖像能力的超分辨成像技術，為生物組織納米結(jié)構(gòu)的活體研究開辟了一條新的途徑。遺憾的是，古斯塔夫森于2011年因癌癥去世，享年51歲，無緣此次的諾貝爾獎。

展望

由于上述光學先驅(qū)的貢獻解決了光學顯微成像領域中長達一個半世紀之久的難題，并在很短的時間內(nèi)形成了一個全新的研究領域，其科學意義顯而易見。早在十年前，不少同行學者已認為光學超分辨成像領域的幾位先驅(qū)將有望獲諾貝爾獎。事實上，當時人們甚至比現(xiàn)在更為樂觀，認為這些技術能很快達到小分子級的成像精度，從而給生命科學研究領域帶來根本性變革。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，雖然理論上具備了潛力，但在技術上徹底實現(xiàn)這一目標仍存在諸多挑戰(zhàn)。因此，超分辨光學成像領域的后續(xù)發(fā)展空間仍十分巨大，孕育著新理論、新技術，并有著在生命科學、納米科學等相關領域獲得進一步廣泛應用的諸多機會。諾貝爾獎評獎委員會在實現(xiàn)這些美好愿景尚有一段距離的時候，將2014年度的化學獎頒給該領域的科學家，略顯意外。簡言之，即使該領域在短期內(nèi)很難被再次授予諾貝爾獎，仍有望產(chǎn)生諾貝爾獎級的研究成果。

長期以來，諾貝爾獎評獎的大致標準還是比較明確的。首先是關注研究成果的原創(chuàng)性，一般都是獎勵給一個研究領域中最早的概念提出者或是核心現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)者。那些針對后續(xù)問題開展跟蹤性研究的同行。即使也曾做出卓越的貢獻，但往往喪失了獲獎機會。其次是關注這些原創(chuàng)成果在人類文明進程中產(chǎn)生的影響力。影響力的產(chǎn)生主要來自于兩方面：或者是通過重要科學發(fā)現(xiàn)來加深人們對宇宙或自然規(guī)律的理解，或者是通過重大技術發(fā)明推動人類物質(zhì)文明的進步。相比于在那些已獲認可的熱門領域開展跟蹤性研究。從事原創(chuàng)性研究面臨著更高的風險，并且即使能夠成功，短期內(nèi)其價值也未必能迅速獲得認可并產(chǎn)生充分影響。扭轉(zhuǎn)這一狀況，促進開展那些可能產(chǎn)生顯著影響力的原創(chuàng)研究，可能需要更加包容的氛圍。以促進思想和理念的多樣化；需要更加寬松的環(huán)境，以降低功利的影響并鼓勵獨立的科學判斷；還需要撇棄浮躁的心態(tài)，容許科學家長久地專注于那些有挑戰(zhàn)性的科學難題。