胡椒葉片揮發(fā)性成分HS—SPME—GC/MS分析

范睿　郝朝運(yùn)　秦曉威　徐飛　鄔華松

摘 要 以胡椒屬種質(zhì)蔞葉、墨西哥胡椒、假蓽拔為材料，利用頂空固相微萃取-氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)測(cè)定3種種質(zhì)葉片中的揮發(fā)性成分及用面積歸一法計(jì)算其相對(duì)含量。結(jié)果表明：鑒定出蔞葉、墨西哥胡椒、假蓽拔的揮發(fā)性成分59種，其中從蔞葉中共鑒定出揮發(fā)性成分36種，其含量較高的有安息香醛、蓽澄茄油烯和β-石竹烯，相對(duì)含量分別為23.56%、9.36%和8.54%；從墨西哥胡椒中鑒定出揮發(fā)性成分18種，其中含量較高的有肉桂醛、萜品烯和萜品油烯，相對(duì)含量分別為77.98%、5.88%和5.11%；而假蓽菝葉片揮發(fā)性成分有25種，含量較高的有β-石竹烯、羅勒烯和芳樟醇。揮發(fā)性成分的種類(lèi)在3種胡椒屬種質(zhì)中都不相同，總的相對(duì)百分含量也不同，說(shuō)明不同的種質(zhì)，葉片揮發(fā)性成分有一定的差異。

關(guān)鍵詞 胡椒葉片；揮發(fā)性成分；GC-MS

中圖分類(lèi)號(hào) O657；R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Analysis of Volatile Constituents of Black Pepper（Piper nigrum L.）

Leaves by HS-SPME-GC/MS

FAN Rui1，2， HAO Chaoyun1，3， QIN Xiaowei1，2， XU Fei1，3， WU Huasong1，2，3 *

1 Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China

2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan，

571533， China

3 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops，

Wanning， Hainan 571533， China

Abstract The volatile constituents of black pepper leaves from P. betle， P. auritum， P. retrofractum were analyzed by HS-SPME-GC/MS， and the relative contents were determined by normalization of area. A total of 59 volatile components from three kinds of black pepper were identified. 36 constituents were identified from the leaves of P. betle and the most abundant three were 3-Nitrostyrene， Cubebene and β-Caryophyllene and the relative contents were 23.56%， 9.36% and 8.54%， respectively. Eighteen constituents were identified from the leaves of P. auritum and the most abundant three were Cinnamaldehyde， terpinene and Terpinolene and the relative contents was 77.98%， 5.88% and 5.11%， respectively. The volatile components in P. retrofractum were mainly β-Caryophyllene， Ocimene and Linalool. The types and total relative content of the volatile components in the black pepper were different， which indicating that there were some differences in chemical composition among different varieties. The experiment method of HS-SPME with GC/MS could accurately reflect the volatile components in black pepper. The study may provide a theoretical basis for the further development and utilization of the Piper L.

Key words Black pepper leaves； Volatile constituents； GC-MS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.027

胡椒屬（Piper L.）為胡椒科（Piperaceae）重要的泛熱帶組成成分，約有2000個(gè)植物種類(lèi)，胡椒屬含有許多香料作物和民族植物種類(lèi)。以素有“香料之王”美譽(yù)的胡椒（P. nigrum）為例，既是世界最重要的香辛作物之一，又具有藥用價(jià)值和工業(yè)利用價(jià)值，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等[1-2]，在食品工業(yè)上也可用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑[3]。蔞葉（P. betle）也是我國(guó)南方常見(jiàn)的藥用植物，在《本草綱目》、《中藥大辭典》和《本草綱目拾遺》中均有記載，蔞葉根、子、葉皆可入藥，具有祛風(fēng)散寒、行氣化痰、消腫止癢之功效。民間用于治療風(fēng)寒咳嗽、支氣管哮喘、風(fēng)濕骨痛、胃寒痛、妊娠水腫、牙痛等，外用治皮膚濕疹、腳癬[4-5]。在海南的南部，咀嚼蔞葉和檳榔是一種習(xí)俗，具有抑菌護(hù)齒的作用。有關(guān)蔞葉揮發(fā)油成分、化學(xué)成分和營(yíng)養(yǎng)成分已有一些文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，此外，假蓽菝（P. retrofractum）、墨西哥胡椒（P. auritum）、石南藤（P. wallichii）、卡瓦胡椒（P. methysticum）和巖椒（P. pubicatulum）等許多種類(lèi)也具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前，國(guó)內(nèi)白胡椒與黑胡椒藥用成分的提取和研究較多[8-11]，但鮮見(jiàn)對(duì)胡椒屬葉片香氣成分研究的報(bào)道，本研究采用HS-SPME（頂空固相微萃?。┘夹g(shù)和GC/MS（氣質(zhì)聯(lián)用儀）技術(shù)分析了胡椒屬3種植物葉片的香氣成分，從色譜圖中鑒定出成分，并在質(zhì)譜庫(kù)中查找結(jié)果，鑒定出的結(jié)果有利于胡椒屬植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。因此，對(duì)胡椒屬葉片香氣成分研究分析對(duì)于胡椒資源的研究與開(kāi)發(fā)有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2013年8月1～20日在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所產(chǎn)品加工分析檢測(cè)室進(jìn)行。

1.1.2 植物材料 胡椒鮮葉于2013年8月采自農(nóng)業(yè)部萬(wàn)寧胡椒種質(zhì)資源圃，所選材料為蔞葉、墨西哥胡椒和假蓽拔種質(zhì)的成熟葉。

1.1.3 儀器與試劑 AL104電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；7890A/5975C GC/MS聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄，美國(guó)安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 SPME取樣 先將首次使用的固相微萃取的萃取纖維頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化，老化溫度為250℃，老化時(shí)間為30 min。取1 g胡椒種質(zhì)葉片置于15 mL密封頂空樣品瓶中，在60 ℃水浴中用固相微萃取纖維頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS頂空萃取30 min，然后在250 ℃條件下解吸8 min進(jìn)樣。

1.2.2 GC/MS分析 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；柱初始溫度50 ℃，以10 ℃/min升溫至85 ℃，然后以2 ℃/min升溫至100 ℃，以8 ℃/min升溫至140 ℃，以6 ℃/min升溫至200 ℃，以15 ℃/min升溫至280 ℃；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流量1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

1.2.3 定性和定量分析 將氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析得到的質(zhì)譜圖利用計(jì)算機(jī)質(zhì)譜Nist08.L數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]進(jìn)行定性；然后將胡椒化合物各組分的相對(duì)含量根據(jù)色譜圖按峰面積歸一化法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

按上述試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，其在EI模式下的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖如圖1～3所示。采用計(jì)算機(jī)檢索和人工解析各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖，共鑒定出 59種化合物，定性結(jié)果及相對(duì)含量見(jiàn)表1。

2.1 3種胡椒揮發(fā)性化合物的分類(lèi)

經(jīng)GC/MS分析，測(cè)得蔞葉共有揮發(fā)性化合物成分36種，相對(duì)含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的92.52%；墨西哥胡椒有18種，相對(duì)含量為 99.23%；假蓽菝有25種，相對(duì)含量為85.77%。由此可見(jiàn)，不同胡椒種質(zhì)其揮發(fā)物的組分之間差異明顯，將鑒定出的3種胡椒的揮發(fā)性成分劃分為烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)共6 類(lèi)化合物，各類(lèi)的組分及含量如圖4所示。由圖4可知，蔞葉中烴類(lèi)化合物的組分最多，有20種，相對(duì)含量?jī)H為46.98%；醛類(lèi)化合物組分較少，有5種化合物，但相對(duì)含量達(dá)24.67%；酯類(lèi)化合物的組分有3種，而相對(duì)含量?jī)H有5.11%。與蔞葉不同，墨西哥胡椒中醛類(lèi)化合物的相對(duì)含量最高，其次是烴類(lèi)化合物，相對(duì)含量在1.00%以上的組分均不到總數(shù)的一半。假蓽菝中烴類(lèi)化合物的組分和含量最高，其次是烴類(lèi)化合物，在25種化合物中相對(duì)含量在1.00%以上的組分有13種，相對(duì)含量達(dá)80.44%。總之，在3種胡椒的揮發(fā)物中，烴類(lèi)和醛類(lèi)這2種化合物的組分和相對(duì)含量均占有絕大部分的比例。

2.2 3種胡椒主要揮發(fā)性成分的比較

3種胡椒的主要揮發(fā)性成分及相對(duì)含量見(jiàn)表1，其中列出了3種胡椒種質(zhì)中的化合物名稱(chēng)、分子式及相對(duì)含量。由表1可知，3種胡椒含有共有的化合物僅4種，為β-石竹烯、α-石竹烯、月桂烯、大牛兒烯D，而且其含量有較大的差異。安息香醛、蓽澄茄油烯這2種化合物相對(duì)含量為32.92%，是蔞葉的主要香氣成分；肉桂醛是構(gòu)成墨西哥胡椒的主要香氣成分，相對(duì)含量達(dá)到77.98%；假蓽菝的主要香氣成分為β-石竹烯、芳樟醇、羅勒烯3種化合物，它們的相對(duì)含量為47.94%。此外，均有其獨(dú)有的化合物成分，如蓽澄茄油烯、β-反式羅勒烯等。

3 討論與結(jié)論

風(fēng)味成分分析方法有很多種，如溶劑萃取、蒸餾萃取和固相微萃取等。其中，固相微萃取技術(shù)（solid phase micro-extraction，SPME）屬于非溶劑型萃取法，是一種新的采樣技術(shù)，其裝置簡(jiǎn)單、操作方便，能與其他分析儀器聯(lián)用，對(duì)揮發(fā)性和半揮發(fā)性的有機(jī)物進(jìn)行分析測(cè)定。目前，研究者多采用HS-SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)對(duì)食品、香料等風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)。如汪立平等[16]采用該技術(shù)建立了快速測(cè)定蘋(píng)果酒中香氣物質(zhì)的方法；李寧等[17]應(yīng)用固相微萃取法采用3種不同萃取纖維，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析測(cè)定一種國(guó)外奶味香精中的揮發(fā)性成分共51種，其中該種奶味香精的主要組成成分酯類(lèi)、醛酮類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)化合物的含量最高?？梢?jiàn)，固相微萃取技術(shù)已在環(huán)保[18]、食品[19]、香料[20]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并取得良好的效果。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)胡椒屬不同種質(zhì)的揮發(fā)性成分，鑒定出揮發(fā)性成分59種，主要成分為烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)。同時(shí)采用GC-MS分析其化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔞葉、墨西哥胡椒、假蓽菝3種不同胡椒種質(zhì)葉片的主要化合物成分為石竹烯，這和張水平等[21]對(duì)胡椒精油進(jìn)行GC-MS分析的結(jié)果一致，石竹烯在果與葉中含量最高，具有較強(qiáng)辛辣氣味，是胡椒特殊辛辣風(fēng)味主要的來(lái)源；β-石竹烯對(duì)動(dòng)物具有抗炎作用，而且有一定的鎮(zhèn)靜作用，具有抗腫瘤的活性[21]，屬于天然等同香料和人造香料，在丁香葉和莖、肉桂葉中均有報(bào)道[22]。假蓽菝含有的羅勒烯具有草香、花香并伴有橙花油氣息，可用于多種日化香精配方中。墨西哥胡椒中含有的萜品油烯呈芳香的松木香氣，微帶甜的柑橘風(fēng)味；另外，發(fā)現(xiàn)肉桂醛的相對(duì)含量在墨西哥胡椒中非常高，達(dá)到77.98%，肉桂醛是傳統(tǒng)中藥肉桂揮發(fā)油中的主要成分，有特殊的肉桂香味，已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)為一個(gè)安全的食品級(jí)化學(xué)品[23]，天然存在于斯里蘭卡肉桂油、桂皮油、風(fēng)信子油和玫瑰油等精油中[24]。具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等[25-26]豐富的藥理作用，且毒副作用低。近年來(lái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肉桂醛具有抗腫瘤和抗突變[27]作用，肉桂醛抗腫瘤活性的研究越來(lái)越引起人們廣泛關(guān)注。

胡椒瘟病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的，胡椒主栽品種抗瘟病能力差，已成為威脅其產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題[28]。通過(guò)長(zhǎng)期抗病性鑒定研究，發(fā)現(xiàn)墨西哥胡椒是高抗胡椒瘟種質(zhì)，同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)墨西哥胡椒中葉片中含有的大量肉桂醛，有研究表明肉桂醛作用下辣椒疫霉菌絲的徑向生長(zhǎng)、辣椒疫霉孢子的萌發(fā)與活力、辣椒疫霉孢子內(nèi)活性氧（Ros）含量和 NADPH 氧化酶基因（nox）的表達(dá)以及外援Ros清除劑谷胱甘肽（GSH）存在下肉桂醛對(duì)辣椒疫霉孢子生長(zhǎng)產(chǎn)生了影響[29]，推測(cè)肉桂醛可能與墨西哥胡椒的抗病性有關(guān)系，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究，這為胡椒瘟病的研究提供了新思路。胡椒葉片的揮發(fā)性成分中不僅含有可以用作香精香料的原料成分，而且含有具生物活性的萜類(lèi)成分，該研究對(duì)于胡椒屬種質(zhì)葉片的綜合利用、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要意義。

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