海藻酸鈉—聚乙烯醇交聯(lián)微球制備參數(shù)優(yōu)化研究

王瑩　汪航　曾日中　黃茂芳　桂紅星

摘 要 采用海藻酸鈉和聚乙烯醇為包埋劑，選取交聯(lián)時(shí)間、海藻酸鈉和聚乙烯醇用量比（SA ∶ PVA）以及海藻酸鈉和聚乙烯醇的總濃度為影響因素設(shè)計(jì)L49（52×7）正交實(shí)驗(yàn)，探討包埋的最佳理化條件。以包埋材料的成球效果，包埋小球的硬度、彈性及微觀結(jié)構(gòu)為考察指標(biāo)，比較包埋小球性能，探討包埋條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)SA ∶ PVA為7 ∶ 3，總濃度為4%，交聯(lián)時(shí)間為24 h時(shí)包埋效果最佳。

關(guān)鍵詞 包埋固定化；海藻酸鈉；聚乙烯醇；正交實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào) X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Optimization of Producting Immobilized Ball by

Sodium Alginate and Polyvinyl Alcohol

WANG Ying1， WANG Hang3， ZENG Rizhong2， HUANG Maofang1， GUI Hongxing1 *

1 Agricultural Product Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Zhanjiang， Guangdong 524001， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

3 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract Sodium alginate（SA）-polyvinyl alcohol（PVA）is often used for the immobilization of microorganisms which are used in wastewater treatment system. But previous research often chose treatment efficiency as the main indicator of immobilized condition selection. This study attempts to explore the immobilized condition from the characteristics of immobilized materials. Research by sodium alginate and polyvinyl alcohol as immobilized materials， an orthogonal experiment by three factors with 52×7 levels L49（52×7）was designed to explore the best immobilized condition. The four factors were crosslinking time， the ratio of sodium alginate and PVA（SA ∶ PVA）and the total concentration of sodium alginate and polyvinyl alcohol. Based on the balling effect， hardness and microstructure of the immobilized ball， the results showed that the optimized condition of immobilized was SA ∶ PVA ratio of 7 ∶ 3， the total concentration of 4%， the cross-linking time 24 h.

Key words Immobilize； Sodium alginate； Polyvinyl alcohol； Orthogonal experiment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.024

包埋法固定化是一種將菌體包埋于各種多孔載體中，使菌體固定化的方法。微生物包埋固定后，可以有效防止微生物流失，增加其局部濃度，以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器快速啟動(dòng)并提高活性和耐沖擊性[1]。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、明膠、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等。有研究結(jié)果表明，瓊脂強(qiáng)度較差，聚丙烯酰胺凝膠對(duì)生物有毒性，明膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)密實(shí)，傳質(zhì)性能差[2]。在眾多固定化材料中，國內(nèi)外研究者針對(duì)海藻酸鈉（SA）和聚乙烯醇（PVA）作為復(fù)合包埋材料處理廢水的研究應(yīng)用最為廣泛[3]，使用這2種材料混合制作載體，克服了材料各自的缺點(diǎn)，制成的載體材料形狀規(guī)則，不出現(xiàn)粘連現(xiàn)象[4-5]。SA和PVA復(fù)合化學(xué)交聯(lián)后形成互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠結(jié)構(gòu)，可以保證較高的機(jī)械強(qiáng)度[6]。魏大鵬等[7]利用SA-PVA復(fù)合材料包埋混合菌劑制成的固定化小球處理養(yǎng)殖廢水，24 h氨氮及亞硝態(tài)氮的去除率達(dá)到96%及98%。馬挺等[8]利用SA-PVA共固定化細(xì)胞脫除燃料油中的有機(jī)硫，總脫硫率達(dá)到87.64%，固定化細(xì)胞可重復(fù)使用5次，使用時(shí)間最多可達(dá)到250 h以上。大部分研究者集中研究去除效果來優(yōu)化包埋固定化的條件[7，9-10]，而利用包埋小球本身機(jī)械性能作為優(yōu)化指標(biāo)的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道。本研究選取SA和PVA作為制備包埋材料的基材，以硼酸和CaCl2的混合溶液作交聯(lián)劑，研究交聯(lián)時(shí)間、SA和PVA用量比以及SA和PVA的總濃度對(duì)包埋小球性能的影響，從中找尋規(guī)律，為包埋固定化條件的優(yōu)選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

包埋劑：SA國產(chǎn)化學(xué)純，PVA為進(jìn)口分裝分析純；交聯(lián)劑：CaCl2，H3BO3，NaCO3均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 包埋小球的制備 以海藻酸鈉和聚乙烯醇作為制備包埋材料的基材，以硼酸和CaCl2的混合溶液（NaCO3調(diào)節(jié)pH至6.7）作交聯(lián)劑，機(jī)械攪拌混合均勻后，自然滴落成型。

1.2.2 包埋固定化條件優(yōu)選 選擇交聯(lián)時(shí)間、海藻酸鈉和聚乙烯醇用量比以及海藻酸鈉和聚乙烯醇的總濃度為三因素，設(shè)計(jì)表1中的L49（52×7）正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)固定化包埋材料的制備參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 包埋小球硬度彈性測(cè)定 利用Brookfield公司CT3質(zhì)構(gòu)儀對(duì)固定化材料進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn)，測(cè)定固定化小球的硬度、彈性，夾具底座TA-BT-KIT，探頭TA-9型，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載0.07N，測(cè)試速度和返回速度均為0.5 mm/s，循環(huán)2次，每次刺入深度為3 mm，每種材料測(cè)試5個(gè)平行樣的平均值作為其硬度、彈性。

1.2.4 包埋小球微觀結(jié)構(gòu)觀察 依次用濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇，丙酮和乙酸異戊酯，對(duì)制備的固定化小球進(jìn)行溶劑置換，風(fēng)干。液氮脆斷后，選擇完整的斷面進(jìn)行噴鉑處理，采用日本日立公司生產(chǎn)的S-4800型掃描電子顯微鏡觀察固定化小球的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS13.0進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)及主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋固定化條件優(yōu)選

正交實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果見表2。具有代表性的成球效果見圖1。

因?yàn)橹谱餍∏虺跏茧A段考察成球效果，所以不考慮交聯(lián)時(shí)間對(duì)成球效果的影響，成球效果見表2所示編秩。分別考察因素B及因素C對(duì)成球效果是否有影響。結(jié)果見表3、4所示。成球效果的數(shù)值越大代表成球的效果越好，即Mean Rank（MR）值越大代表該水平的成球效果越好。表3-a中MR6>MR5>MR4>MR7>MR3>MR2>MR1，表明SA：PVA值（B）越大成球效果越好，但是單一SA材料的成球效果還是不如混合材料，成球效果最好的SA ： PVA為9 ： 1。表3-b中P為0.009<0.05，表明不同SA ： PVA水平的成球效果有顯著性差異。同樣從表4中可以看出，不同SA+PVA總濃度（C）對(duì)成球效果有差異（p=0.02<0.05），隨著SA+PVA總濃度的上升，成球效果呈現(xiàn)一種先變好再變差的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)SA+PVA總濃度為0.6%時(shí)成球效果最佳。從成球性能來說最佳水平為B6C3，A無影響。

用SPSS13.0軟件對(duì)硬度和彈性測(cè)試結(jié)果進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示不同交聯(lián)時(shí)間組對(duì)比，硬度和彈性無顯著性差異（p硬度=0.197，p彈性=0.505，都大于0.05），交聯(lián)時(shí)間對(duì)包埋小球的硬度和彈性沒有影響。其他2個(gè)因素不同水平組之間硬性和彈性具有顯著性差異，p均小于0.05。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)所得硬度值進(jìn)行極差分析，A，B，C 3因素的R′值分別為0.99，3.32，4.28，R′C> R′B> R′A，所以SA+PVA總濃度（C）對(duì)小球硬度的影響最為重要，影響程度的順序?yàn)镾A+PVA總濃度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交聯(lián)時(shí)間（A），最佳理化條件為A5B7C5。推斷增加材料總濃度、交聯(lián)時(shí)間都能增加包埋小球的硬度，在2種材料中，海藻酸鈉對(duì)硬度影響更加明顯；對(duì)所得彈性值進(jìn)行極差分析，A，B，C 3因素的R′值分別為0.62，1.47，1.93，R′C> R′B>R′A，SA+PVA總濃度對(duì)小球彈性的影響最為重要，影響程度為SA+PVA總濃度>SA ∶ PVA值>交聯(lián)時(shí)間（A），最佳理化條件A3B5C5。

2.2 微觀結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)成球效果與硬度彈性的分析結(jié)果選擇A1B4C3，A5B5C3，A4B6C3及A2B5C2的電鏡圖片進(jìn)行比較，電鏡結(jié)果有3種都能形成較好的網(wǎng)絡(luò)圈套結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有較好的穩(wěn)定性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)相同SA+PVA總濃度（C）的情況下，SA ∶ PVA值（B）較低時(shí)，PVA含量較大（A1B4C3），如圖2-a所示，小球結(jié)構(gòu)緊密，但是孔隙率低不利于物質(zhì)的內(nèi)外傳遞，可能會(huì)對(duì)廢水處理效率有影響。當(dāng)SA ∶ PVA值高時(shí)，SA含量較大（A4B6C3），如圖2-b所示小球結(jié)構(gòu)松散，強(qiáng)度低，容易破碎，固定化的細(xì)菌大部分滲漏使用壽命短。在相同SA ∶ PVA值的情況下，SA+PVA總濃度?。ˋ2B5C2），如圖2-d所示，小球的孔隙率大，有較大的比表面積供細(xì)菌附著，有利于內(nèi)外物質(zhì)傳遞，且更為經(jīng)濟(jì)。所以綜合考慮成球效果，包埋小球硬度及彈性，微觀結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)操作方便（時(shí)間選擇）。選擇的最佳包埋固定化條件為A3B5C2，也就是SA ∶ PVA為7 ∶ 3，總濃度為4%，交聯(lián)時(shí)間為24 h。

3 討論與結(jié)論

SA+PVA總濃度相同時(shí)，SA ∶ PVA值（B）越大成球效果越好，但是單一SA材料的成球效果不如混合材料。孫麗慧等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)SA濃度高，PVA濃度低時(shí)，固定化細(xì)胞容易成球。隨著SA量的增加固定化小球的孔隙率增大，強(qiáng)度也有所增加，但是彈性差，易破碎[13]。PVA濃度太低時(shí)固定化小球的機(jī)械穩(wěn)定性較差，而且固定化小球使用后表面易出現(xiàn)破裂和小孔，固定化小球機(jī)械強(qiáng)度的損耗很大程度上是由于海藻酸鈣受到腐蝕溶解導(dǎo)致的[14]。為實(shí)現(xiàn)固定化小球的重復(fù)利用，保持較好的機(jī)械穩(wěn)定性，需要綜合考慮其他性能決定最佳配比。

不同總濃度（C）對(duì)成球效果有差異（p=0.02<0.05），隨著SA+PVA總濃度的上升，成球效果呈現(xiàn)一種先變好再變差的趨勢(shì)，當(dāng)SA+PVA總濃度為6%時(shí)成球效果最佳。SA+PVA總濃度（C）對(duì)小球硬度彈性的影響最為重要，影響程度的順序均為SA+PVA總濃度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交聯(lián)時(shí)間（A）。最佳理化條件分別為A5B7C5、A3B5C5。在SA+PVA總濃度較低的情況下，形成的小球結(jié)構(gòu)松散，表面張力不夠，表現(xiàn)出不規(guī)則形狀，而且在攪拌過程中，容易被機(jī)械攪拌器破壞；當(dāng)SA+PVA總濃度適中時(shí)，在機(jī)械攪拌下易被分散，交聯(lián)劑加入后，能快速與SA+PVA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使乳滴固化保持現(xiàn)有球形；在SA+PVA總濃度太高，溶液粘度超過一定限度，相同制作條件乳滴趨向更大，與滴嘴的接觸面也加大，不易滴落，容易拖尾，交聯(lián)劑加入后不能及時(shí)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使微球固化，在攪拌過程中，容易被機(jī)械攪拌器破壞形成破損的半球[15]。

小球的硬度與彈性結(jié)果顯示交聯(lián)時(shí)間對(duì)包埋小球機(jī)械性能的影響沒有顯著性差異，賴子尼等[16]同樣采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)海藻酸鈉-聚乙烯醇進(jìn)行硬度的分析，得到交聯(lián)時(shí)間能夠較大程度改變凝膠硬度的結(jié)果。與本文結(jié)果有較大出入，推測(cè)原因可能是，賴子尼等人選擇交聯(lián)時(shí)間為15～45 min，而本文選擇時(shí)間為12～36 h，在交聯(lián)發(fā)生的初始階段混合材料與交聯(lián)劑的反應(yīng)時(shí)間對(duì)材料的硬度有較大影響，而后逐漸減弱，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間達(dá)到12 h時(shí)，包埋材料已經(jīng)完全交聯(lián)，再增加交聯(lián)時(shí)間不會(huì)影響包埋小球彈性和硬度，不需要作為主要考慮對(duì)象。三因素對(duì)小球機(jī)械性能影響程度的順序?yàn)镾A+PVA總濃度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交聯(lián)時(shí)間（A）。最佳理化條件分別為A5B7C5，A3B5C5。隨著SA ∶ PVA值的增大彈性呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，這也與廖強(qiáng)等[13]所得的結(jié)果比較相符，廉哲等[17]也發(fā)現(xiàn)隨SA含量增加，SA+PVA水凝膠拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，且在SA ∶ PVA值為7 ∶ 3時(shí)達(dá)最大值。

綜合考慮成球效果，包埋小球硬度及彈性，微觀結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)操作方便（時(shí)間選擇）。選擇的最佳包埋固定化條件為A3B5C2，也就是SA ∶ PVA為7 ∶ 3，總濃度為4%，交聯(lián)時(shí)間為24 h。本研究主要以制作完成的包埋小球力學(xué)性能及微觀結(jié)構(gòu)來探討包埋條件，為固定化小球的實(shí)際使用提供一定的理論基礎(chǔ)。對(duì)今后力學(xué)性能及微觀結(jié)構(gòu)的變化還有待進(jìn)一步研究。

致 謝 楊春亮研究員、余和平研究員和課題組其他成員在實(shí)驗(yàn)過程給予的指導(dǎo)或幫助，在此表示感謝！

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