天然彩色蠶繭繭層中色素含量及抗氧化物活性的測(cè)定

丁農(nóng)　張金衛(wèi)　金瑞豐　李江濤　 馮世明　魚南洋　陸萍　李衛(wèi)旗

摘要 [目的] 為彩色繭蠶絲蛋白應(yīng)用于化妝品等產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。[方法]對(duì)幾個(gè)不同顏色的彩色繭蠶品種進(jìn)行繭層色素含量和抗氧化性能測(cè)定。[結(jié)果] 綠色繭繭殼中類黃酮色素的含量最高，為0.521 mg/g，是白色繭的4.65倍；黃色繭繭殼次之，而白色繭和紅色繭最低。黃色繭和紅色繭類胡蘿卜素含量均在0.5 mg/g以上，是白色繭和綠色繭的8倍以上。綠色繭繭層中抗氧化物活性最高，為217.5 U/g；黃繭繭層中抗氧化物活性次之，而紅繭和白繭較低。[結(jié)論]與白色蠶繭相比，綠色蠶繭含有較高的類黃酮，而黃色繭和紅色繭有較高的類胡蘿卜素，抗氧化能力也是天然彩色繭顯著高于白色繭。

關(guān)鍵詞 天然彩色繭；色素含量；抗氧化物；測(cè)定

中圖分類號(hào) S886 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）11-139-03

繭絲的化學(xué)組成主要有絲素和絲膠2種蛋白質(zhì)，其占比絲素蛋白約為75%，絲膠蛋白約為25%。我國(guó)的蠶繭生產(chǎn)除了主要作為絲綢服飾面料及蠶絲被的原料外，正在向生物醫(yī)藥材料、化妝品材料和保健食品材料等非傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域的拓展[1]。繭色受控于基因表達(dá)的天然彩色繭品種由于其繭絲中的色素來(lái)源于蠶食下的桑葉或蠶體內(nèi)的合成，色澤柔和、自然及環(huán)保，其開發(fā)利用價(jià)值已經(jīng)引起人們的重視，可共生產(chǎn)應(yīng)用的天然彩色繭品種也相繼育成[2]。與普通白色繭相比，天然彩色繭富含有類黃酮色素和類胡蘿卜素色素等生物活性物質(zhì)，在繅絲生產(chǎn)過(guò)程也產(chǎn)生大量的富含天然有機(jī)色素的繭衣和下繭、長(zhǎng)吐等下腳料副產(chǎn)品，如果將它們回收二次利用，作為富含類黃酮、類胡蘿卜素的蠶絲蛋白原料開發(fā)化妝品等產(chǎn)品將對(duì)資源的綜合利用和保護(hù)環(huán)境都有十分重要的意義。筆者對(duì)選育的幾個(gè)不同顏色的彩色繭品種進(jìn)行了繭層色素含量與抗氧化性能測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種。選育的黃色繭金玉、綠色繭LJ、紅色繭RC，以白色繭秋豐為對(duì)照。

1.1.2 主要試劑。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、β-胡蘿卜素、標(biāo)準(zhǔn)SOD（15KU）、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶（均為Sigma公司產(chǎn)品）以及甲-萘胺、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、75%乙醇和磷酸緩沖液（65 mmol/L，pH 7.8）。所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器。島津 UV-2450紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、超聲波儀、電熱恒溫水浴鍋、立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫烘箱。

1.2 方法

1.2.1 蠶繭繭殼中色素和抗氧化物的提取。取干凈的供試蠶繭繭殼用純水洗滌后冷風(fēng)吹干，剪碎后用電子天平準(zhǔn)確稱取0.5 g，放入潔凈試管中，加入10 ml 75%的乙醇，然后超聲波儀超聲30 min，再在60 ℃的水浴鍋里抽提4 h，過(guò)濾后去除雜質(zhì)，收集第1次抽提的濾液，將剩余的殘?jiān)貜?fù)抽提1次，將濾液合并定容于25 ml標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，放置于4 ℃的冷藏箱中過(guò)夜，測(cè)定時(shí)吸取上層液作為試驗(yàn)的試樣液。

1.2.2 黃酮類色素的測(cè)定。

類黃酮的測(cè)定采用硝酸鋁顯色法[3]，具體原理為黃酮化合物在有亞硝酸鈉和中性條件下與鋁鹽反應(yīng)生成螯合物，在加入氫氧化鈉溶液后呈現(xiàn)紅橙色，在499 nm處有最大吸收波峰，然后用比色法測(cè)定黃酮類化合物的含量。

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

用電子天平準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用50 ml的容量瓶定容為0.2 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、4、5和6 ml后加入5%的NaNO2溶液300 μl，混勻后靜置6 min，再加入10%的Al（NO3）3溶液300 μl，混勻后靜置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 ml，混勻后加入75%的乙醇定容為25 ml，使蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0、0.008、0.016、0.032、0.040和0.048 mg/ml，在波長(zhǎng)499 nm下測(cè)定其吸光度值，空白對(duì)照用純水作同樣處理，3次重復(fù)。得到回歸方程為：Y=12.329 9X-0.000 3，相關(guān)系數(shù)為R.2=0.998 9。測(cè)試樣品的濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1）。

1.2.2.2 試樣黃酮類色素含量的測(cè)定。

取試樣液5 ml，加入5%的NaNO2溶液300 μl，搖勻靜置6 min后再加入10%的Al（NO3）3溶液300 μl，混勻靜置6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 ml，混勻后再加入75%的乙醇定容至10 ml，然后用分光光度計(jì)于499 nm處測(cè)定其吸光度，空白對(duì)照用純水并作相同處理。根據(jù)檢測(cè)到的吸光度值計(jì)算出樣品中的類黃酮含量，然后依據(jù)將0.5 g繭殼抽提出25 ml的試樣液和稀釋倍數(shù)，計(jì)算出供試蠶繭單位重量繭殼的類黃酮含量。

1.2.3 類胡蘿卜素的測(cè)定。

類胡蘿卜素的測(cè)定采用光度法測(cè)定[4]，具體原理為：類胡蘿卜素易溶于有機(jī)溶劑而不溶于水，可用乙醚提取分離。皂化劑KOH-CH3OH能與供試液中的類黃酮及含羧基、羥基的色素生成可溶于水的鹽，類胡蘿卜素則無(wú)此類反應(yīng)，因而可用乙醚將類胡蘿卜素抽提出來(lái)，達(dá)到將類胡蘿卜素與其他色素分離的目的。β-胡蘿卜素的最大吸收波峰是449 nm，采用比色法對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定試樣液含量。

1.2.3.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

用電子天平精確稱取β-胡蘿卜素0.5 mg，置于50 ml的容量瓶中加入75%的乙醇溶液定容成為0.01 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，分別取0、1、2、4、5和6 ml 0.01 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 ml的容量瓶中，得到0、0.4、0.8、1.6、2.0和2.4 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，在波長(zhǎng)449 nm處測(cè)定其吸光度，空白對(duì)照用純水作同樣處理，3次

重復(fù)。得到回歸方程為Y=0.163 8X-0.004 3，相關(guān)系數(shù)為R.2=0.999 7。從圖2可以看出，β-胡蘿卜素濃度與其對(duì)應(yīng)的吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 試樣類胡蘿卜素含量的測(cè)定。

取供試液1 ml，加入20%質(zhì)量比的KOH-CH3OH溶液2.5 ml，置于4 ℃冷藏箱遮光條件下過(guò)夜，用分液漏斗加乙醚5 ml，將供試液移入再加入10%的NaCl溶液5 ml，靜置分層后將上層濾液移入小燒杯，對(duì)下層液繼續(xù)萃取，合并濾液，用10%的NaC溶液l5 ml洗滌4次，再倒入同樣的燒杯中，加入2 g無(wú)水Na2SO4干燥處理30 min，然后用乙醚定容至10 ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)449 nm處測(cè)定其吸光度值，對(duì)照用純水作同樣處理。根據(jù)吸光度值，計(jì)算出供試樣類胡蘿卜素的含量，然后依據(jù)0.5 g繭殼樣品抽提為25 ml的供試液和測(cè)試液的稀釋倍數(shù)計(jì)算出供試蠶繭單位重量繭殼的類胡蘿卜素含量。

1.2.3 抗氧化物的測(cè)定。

采用黃嘌呤氧化-羥胺法[5]測(cè)定試樣的抗氧化物SOD（超氧化物歧化酶）值，具體原理為：黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2.-），與羥胺反應(yīng)生成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與甲萘胺和對(duì)氨基苯磺酸反應(yīng)生成紅色化合物，用分光光度計(jì)在530 nm下進(jìn)行比色測(cè)定，而超氧化物歧化酶抑制此反應(yīng)，使得超氧陰離子自由基（O2.-）與羥胺反應(yīng)產(chǎn)生的亞硝酸鹽減少，據(jù)此來(lái)建立SOD百分抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將供試樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線對(duì)照，按照以下公式計(jì)算出供試樣品提取液的抗氧化活性：SOD百分抑制率（%）=（對(duì)照管吸光度值-測(cè)定管吸光度值）/對(duì)照管吸光度值×100。

1.2.3.1 SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立。將標(biāo)準(zhǔn)品SOD用65 mmol/L的磷酸緩沖液配制成750 U/ml的溶液后稀釋50倍，稀釋成15 U/ml的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，再將其分別稀釋為0、0.005、0.025、0.045、0.065、0.085、0.105、0.125、0.145、0.165和0.205 U/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶

液。最后，采用黃嘌呤氧化-羥胺法測(cè)定SOD的活性并建立標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。SOD的測(cè)定方法見表1。

按上述方法對(duì)SOD各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的活性測(cè)定，得到相對(duì)應(yīng)濃度的SOD抑制率，建立SOD的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。從圖3可以看出，抑制率在65%以內(nèi)時(shí)其SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的線性良好。

1.2.3.2 試樣抗氧化物的測(cè)定。

取按照“1.2.1”中的方法得到的供試液的上層液20 μl，測(cè)定試樣的吸光度，計(jì)算試樣液的SOD百分抑制率，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線獲得供試液的抗氧化活性。

供試蠶繭單位重量繭殼的抗氧化物含量（U/g），是將供試樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)與SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線進(jìn)行比對(duì)，將檢測(cè)樣品的百分抑制率所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液SOD濃度值設(shè)定為W（SOD）（單位為U/ml），再根據(jù)試樣的稀釋倍數(shù)按照以下公式計(jì)算：繭層的抗氧化物（U/g）=[W（SOD） U/ml×5.8 ml×25 ml]/（0.02 ml×0.5 g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同色彩蠶品種繭殼的類黃酮色素含量從表2可以看出，綠色繭品種LJ繭殼中的類黃酮含量最高，達(dá)到0.521 mg/g，大幅高于其他品種，分別為黃色繭HJ、紅色繭RC和白色繭品種秋豐的2.56倍、3.64倍和4.65倍。

2.2 不同色彩蠶品種繭殼的類胡蘿卜素含量從表3可以看出，黃色繭品種金玉與紅色繭品種RC的類胡蘿卜素含量較高，其中黃色繭金玉為0.508 mg/g、紅色繭RC為0.529 mg/g，是白色繭秋豐和綠色繭LJ的8～10倍左右。

2.3 不同色彩蠶品種繭殼的抗氧化物活性從表4可以看出，各種色彩的蠶繭均有抗氧化活性，其大小順序依次為綠色繭LJ>黃色繭>紅色繭RC>白色繭秋豐。由此可見，彩色繭與白色繭相比具有更高的抗氧化活性。

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，與白色蠶繭相比天然綠色蠶繭含有較高的類黃酮，而天然黃色繭和紅色繭有較高的類胡蘿卜素，抗氧化能力也是天然彩色繭顯著高于白色繭?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)類黃酮和類胡蘿卜素具有多種生理調(diào)節(jié)功能，其中類黃酮具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖和抗自由基等功能，而類胡蘿卜素具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用[6-9]。SOD作為生物體內(nèi)的一種極為重要的天然抗氧化物，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，具有生命體消除新陳代謝過(guò)程中有害物質(zhì)的重要功能，可以有效清除自由基，提高免疫力和抗衰老[10]。選育天然彩色繭品種，生產(chǎn)開發(fā)天然彩色絲產(chǎn)品特別是保健內(nèi)衣，產(chǎn)品色澤柔美，加工無(wú)需印染更加環(huán)保，而且含有天然色素和抗氧化物對(duì)皮膚的保健及親和力更好，符合人們對(duì)“健康、綠色”的追求。目前，以SOD為主要護(hù)膚成分的化妝品和以蠶絲蛋白為主要護(hù)膚成分的化妝品層出不窮，以天然彩色繭原料開發(fā)出含有天然色素和抗氧化物質(zhì)的蠶絲蛋白化妝品由于其天然環(huán)保的特點(diǎn)將會(huì)受到市場(chǎng)的更加青睞。筆者對(duì)保存的彩色繭育種材料進(jìn)行了色素及抗氧化活性檢測(cè)，由于彩色繭品種育種素材眾多，各種繭色相似的彩色繭品種其色素和抗氧化活性表現(xiàn)是否一致，還有待于進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯 陳玉敏 責(zé)任校對(duì) 況玲玲