江蘇省豬流行性腹瀉病毒的流行病學調查

趙振鵬　楊振　林偉東　秦愛建　金文杰

摘要 [目的] 分析江蘇省豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的流行和變異情況。[方法] 采用RT-PCR方法對2013年3月至2014年12月從江蘇省9個不同地區(qū)采集的174份病料進行病原學檢測和流行病學調查，并對來自不同地區(qū)9株病毒的部分M基因進行克隆、測序和分析。[結果] 江蘇省PEDV的個體陽性率為17.92%，豬場陽性率為61.54%；與經典病毒株CV777相比，9株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列都有突變。同源性分析表明，江蘇省內PEDV毒株的核苷酸同源性為97.8%～100.0%，但與歐洲毒株的同源性較低；遺傳進化分析表明，江蘇省PEDV流行株和參考株可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個群，7株江蘇省毒株和一些其他國內毒株、泰國毒株、韓國毒株以及美國毒株屬于Ⅰ群，而另外2株江蘇株與2株泰國株構成了Ⅲ群，而現用疫苗株CV777則屬于Ⅱ群。[結論]江蘇省內PEDV有一定程度的進化和變異，并且需要選擇更有效的疫苗株來控制PEDV的流行。

關鍵詞 豬流行性腹瀉病毒；江蘇省；流行病學調查；M基因；遺傳變異

中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-125-03

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea， PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的以水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要癥狀的豬腹瀉性疾病[1]，該病最先在英國發(fā)現[2]，歐洲和亞洲是主要的流行區(qū)域[3-6]，但近年來該病在美國大規(guī)模爆發(fā)[7-9]，我國在1980年就有該病發(fā)生的相關報道，自2010年以來我國又爆發(fā)了大規(guī)模的PED[10-14]，各個年齡段豬均發(fā)病，仔豬致死率極高，且全季節(jié)都可發(fā)病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。

PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronavirinae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），其基因全長約28 kb，包括5端非翻譯區(qū)、3端非翻譯區(qū)和至少7個開放閱讀框（5-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3），主要編碼4種結構蛋白（纖突蛋白S、膜蛋白M、核衣殼蛋白N、小膜蛋白E）以及2種非結構復制多聚酶（復制酶1a和1b）和1種非結構輔助蛋白[15]。其中，M基因特別保守，它的突變更能體現病毒的變異情況，通常用來作為檢測病毒的靶基因。筆者運用RT-PCR檢測方法對江蘇省13個豬場174份豬腹瀉糞便或腸組織病料進行PEDV病原調查，并通過分析PEDV的部分M基因序列來了解PEDV在江蘇省的分布情況和變異情況，旨在為該病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料來源 2013年3月至2014年12月從江蘇省揚州、南通、常州、泰州、宿遷、鹽城、大豐、濱海、連云港9個地區(qū)采集174份小腸內容物或肛拭樣品，所有樣品均來自有明顯腹瀉的仔豬。

1.2 主要試劑 pGEM-T Easy載體和限制性內切酶EcoRⅠ為大連寶生物工程有限公司產品；TRIzol試劑和M-MLV反轉錄酶均為TaKaRa公司產品；質粒DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均為Axygen公司產品；DH5α感受態(tài)細胞由揚州大學獸醫(yī)學院教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室保存。

1.3 引物設計 根據豬流行性腹瀉標準株CV777 M區(qū)部分基因序列，設計1對引物，預期擴增產物大小為370 bp。上游引物為：5′-GGACACATTCTTGGTGGTCT-3′；下游引物為5′-GTTTAGACTAAATGAAGCA-3′。

1.4 樣品處理和目的片段的克隆測序 將采回的病料用PBS緩沖液按1∶5稀釋后凍融2次，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清300 μl按照TRIzol說明書提取總RNA，通過反轉錄合成cDNA，并進行PCR擴增。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將PCR擴增產物通過12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。擴增的PCR產物經膠回收純化，克隆于pGEM-T載體中，轉化到DH5α感受態(tài)細胞內，將含有鑒定陽性的重組質粒的菌液送交Invitrogen公司進行測序。

1.5 序列分析 分別從各個地區(qū)隨機選出1或2毒株，依據采樣的地點和時間序列分別命名為JSBH140210、JSCZ130818、JSDF131228、JSNT131122、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228，使用DNAStar軟件對此9株PEDV 部分M基因及GenBankK 16株參考病毒株（表1）進行核苷酸序列分析，并使用MEGA 5軟件構建基因系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 目的片段的RT-PCR擴增 從病料中提取的總RNA反轉錄合成cDNA，并以此為模板進行M基因擴增，擴增產物用12 g/L的瓊脂糖電泳凝膠檢測。從圖1可以看出，目的片段約為370 bp。

2.2 PEDV的陽性率 由表2可知，PEDV在江蘇地區(qū)有較高的流行率，豬場PEDV平均陽性率為61.54%，而有些地方豬場仔豬感染率達100%。

2.3 目的基因序列分析 M基因的核苷酸序列分析表明，與參考株CV777相比9株江蘇不同地區(qū)的PEDV都有若干點突變。其中，9株江蘇分離株在35位核苷酸由T突變?yōu)锳，在305位核苷酸由T突變?yōu)镃。另外，JSBH140210、JSCZ130818、JSNT131122、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127和JSYZ131228等分離株在290位核苷酸由A突變?yōu)镃，在327位核苷酸由G突變?yōu)門。與參考株CV777相比，推導的氨基酸序列分析表明JSDF131228、JSNT131122在第87位氨基酸由G突變?yōu)镾，JSBH140210、JSCZ130818、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127和JSYZ131228等7株在109位氨基酸由A突變?yōu)镾。使用DNAStar和MEGA.4繪制9株分離株的M基因序列和參考序列之間的核苷酸相似度和系統(tǒng)進化樹（圖2～3）。

3 討論

自2010年以來，PEDV在我國豬場感染嚴重，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失，江蘇省的仔豬腹瀉情況也比較嚴重，但相關的分子流行病學調查卻少見報道。筆者采用RT-PCR方法對江蘇省9個地區(qū)進行PEDV病原調查，結果表明13個規(guī)模化豬場有8個豬場感染，感染率達61.54%；174份病料中陽性病料31份，陽性率達17.92%；有些豬場腹瀉仔豬PEDV感染陽性率更高達100.00%，表明PEDV在江蘇省豬場中普遍存在，必須引起高度重視。

對不同地區(qū)的9株PEDV M基因的核苷酸序列分析，與參考株CV777相比9株江蘇分離株在35位核苷酸由T突變?yōu)锳，但與中國株（HNBF、HNQX）、韓國株（KPEDV-9、M2227、PFF188）、泰國株（08RB03）和美國株（USA/Colorado/2013）相同；在305位核苷酸由T突變?yōu)镃，但與中國株（LJB-03、DX-M、HNBF、HNQX）、韓國株（Chinju99、KPEDV-9、M2227、PFF188）、泰國株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95、08RB03）、美國株（USA/Colorado/2013）等株相同；JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119在第8位核苷酸位點由C突變?yōu)門；JSBH140210、JSCZ130818、JSNT131122、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228等8株在290位核苷酸由A突變?yōu)镃，與中國株（HNBF、HNQX）、泰國株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95、08RB03）、韓國株（PFF188）、美國株（USA/Colorado/2013）相同，在327位核苷酸由G突變?yōu)門，但與中國株（DX-M、HNBF、HNQX）、泰國株（08RB03）、韓國株（PFF188）、美國株（USA/Colorado/2013）株相同。與參考株CV777相比，推導的氨基酸序列分析表明JSDF131228、JSNT131122在第87位氨基酸由G突變?yōu)镾，JSBH140210、JSCZ130818、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228等7株在109位氨基酸由A突變?yōu)镾，但與中國株（DX-M、HNBF、HNQX、BJ201O）、泰國株（08RB03）、韓國株（ PFF188）、美國株（USA/Colorado/2013）相同，這些突變表明江蘇省內流行的PEDV并不完全相同，但突變位點與我國其他地區(qū)、韓國、泰國等周圍國家以及美國暴發(fā)的PEDV有很高的相似性，與歐洲株PEDV相似性不高。這些核苷酸和氨基酸位點的突變能否引起其抗原性的改變還需要進一步研究。

對目的基因的同源性分析表明，江蘇省內PEDV的同源性為97.8%～100.0%，與國內其他分離株的同源性為97.0%～99.7%，與韓國分離株同源性為96.5%～100.0%，與泰國分離株同源性為96.7%～99.5%，與歐洲分離株的同源性為97.8%～98.9%，而與美國新分離株的同源性高達98.6%～100.0%，我國自2010年以來爆發(fā)的PEDV疫情與美國近年來暴發(fā)的疫情之間是否有關聯，也需進一步研究。

基于PEDV目的基因建立的系統(tǒng)進化樹，可將PEDV分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3個群，Ⅰ群包括JSBH140210、JSCZ130818、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228和其他中國株（BJ2010、HNBF、HNQX、LJB-03）、韓國株（PFF188、 M2227）、泰國株（08RB03）、美國株（USA/Colorado/2013）；Ⅱ群包括中國株（DX-M、LZC）、韓國株（Chinju99、KPEDV-9）、英國株（Br1/87）以及比利時經典參考株（CV777）；JSDF131228、JSNT131122和2株泰國株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95）組成Ⅲ群。遺傳進化分析表明，江蘇省內大部分PEDV與國內其他地區(qū)分離株、相鄰國家分離株和美國分離株親緣性較近，與歐洲分離株親緣性較遠，這與目的基因的核苷酸分析結果相一致，與董延鵬[16]的研究結果相近。JSDF131228、JSNT131122與泰國1995年和2004年分離的M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95親緣性相近，且在國內未有報道與泰國株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95）同源性如此相近的毒株，表明這2株PEDV可能是由國外傳入變異形成的，其他7株或在選擇壓力下由國內本土毒株或國外毒株傳入變異而成的。江蘇省內很多豬場依舊采用PED（CV777）弱毒苗進行免疫，很有可能由于病毒突變而影響免疫效果，因此針對當下流行的毒株選擇新的疫苗株來控制PED是當務之急。

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