黃河鯉魚源維氏氣單胞菌的分離?鑒定及藥敏試驗

王家禎　耿昕穎　朱世馨　董文龍　賈小營　單曉楓　高云航

摘要 [目的] 為研究鯉魚感染細菌性疾病及其臨床合理用藥提供理論依據(jù)。[方法] 從吉林省某水產(chǎn)養(yǎng)殖場患病黃河鯉魚的脾臟中分離致病菌，并通過常規(guī)生理生化試驗、16S rDNA序列分析對其進行鑒定。應用微量稀釋法測定11種抗生素藥物對其最小抑菌濃度。[結(jié)果] 從患病鯉魚的脾臟中成功分離到1株優(yōu)勢菌。該優(yōu)勢菌為革蘭氏染色陰性桿菌，通過序列比對將其鑒定為維氏氣單胞菌。動物回歸試驗表明該菌株可使黃河鯉發(fā)生死亡。藥敏試驗結(jié)果表明該病原菌對磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物不同程度耐藥，而對氯霉素類藥物、恩諾沙星較為敏感，對強力霉素中介。[結(jié)論] 該研究結(jié)果可為鯉魚源維氏氣單胞菌的防治提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黃河鯉魚；維氏氣單胞菌；16S rDNA；MIC藥敏試驗

中圖分類號 S941.42 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-104-03

黃河鯉（Cyrinus carpio）是產(chǎn)自黃河的主要淡水魚，可通過人工選育優(yōu)質(zhì)個體進行飼養(yǎng)。但是，近年來黃河鯉養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展使養(yǎng)殖密度增加、環(huán)境惡化，導致黃河鯉受到各種病原的侵染，其中細菌性疾病最為廣泛。

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）屬于孤菌科氣單胞菌屬，是革蘭氏陰性桿菌，其分布廣泛常見于淡水、淤泥中，近年來也是比較重要的人魚共患病原菌，可引起人類的肺炎和菌血癥等疾病。同時，維氏氣單胞菌可侵染多個水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，比如異育銀鯽魚（Carassius auratus gibelio）[1]、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[2]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[3]、中華絨螯蟹（Eriocheir Sinensis）[4]、斑點叉尾鮰（Channel catfish）[5]、羅非魚（Oreochromis mossambicus）[6]等。筆者從吉林省某水產(chǎn)養(yǎng)殖場獲得患病鯉魚，解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟胰腺組織液化、脾臟腫大變黑，對其脾臟進行分離并純化后得到1株優(yōu)勢菌，通過常規(guī)生理生化試驗、16S rDNA序列分析鑒定以及MIC藥敏試驗，旨在為研究鯉魚感染細菌性疾病及臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料來源 病魚來自吉林省某水產(chǎn)養(yǎng)殖場瀕死黃河鯉魚，重量在500 g左右。

1.2 主要試劑 TSA瓊脂購自北京路橋技術(shù)有限公司；細菌微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司；pMD18-T vector載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、切膠回收試劑盒均為寶生物工程技術(shù)服務公司產(chǎn)品。根據(jù)臨床常用藥物選擇的11種抗生素均購自北京海洋醫(yī)藥化工生物科技有限公司，分別為環(huán)丙沙星（99.8%）、恩諾沙星（98.9%）、紅霉素（99.7%）、阿奇霉素（99.9%）、氟苯尼考（99.8%）、氯霉素（99.9%）、阿米卡星（99.7%）、慶大霉素（99.8%）、磺胺間甲氧嘧啶（99.7%）、強力霉素（99.8%）、阿莫西林（99.9%）。

1.3 病原菌的分離 選取發(fā)病癥狀明顯的黃河鯉，采集脾臟組織樣品，劃線接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)相似的優(yōu)勢菌群進行純化培養(yǎng)得到1株優(yōu)勢菌株命名為LP1401。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 菌落形態(tài)與菌體形態(tài)觀察。將純化菌接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 動物回歸試驗。

將純化菌株用0.75%無菌生理鹽水制成細菌懸液，用平板涂布計數(shù)法記錄細菌濃度[7]，并根據(jù)細菌濃度將菌液用無菌生理鹽水分別稀釋成2×107、2×108和2×109 CFU/ml。將40條健康黃河鯉魚平均分為4組：1組為對照組，注射無菌生理鹽水，0.2 ml/條；其余3組為感染組，分別注射2×107、2×108、2×109 CFU/ml細菌懸液0.2 ml/條。以上各組均于23 ℃水溫下獨立隔離飼養(yǎng)7 d，觀察鯉魚發(fā)病及死亡情況。

1.4.3 生理生化試驗。參照微量生化反應管說明書及伯杰氏細菌鑒定手冊[7]具體方法，對純化菌進行鑒定。

1.4.4 16S rDNA基因的PCR擴增。提取細菌DNA，作為PCR反應模板。上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTAG；

下游引物：ACGGTTACCTTGTTACGACTTC。

PCR反應體系：模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，dNTP 2.5 μl，10×Buffer 2.5 μl，E×Taq 0.3 μl，ddH2O 16.7 μl，總體系為25 μl。

PCR反應條件：94 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收純化，與pMD18-T載體進行連接，克隆至大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，送至上海生物公司測序。

1.4.5 系統(tǒng)進化樹分析。測序結(jié)果通過Blast軟件進行同源性比對，并與GenBank中的已報道的相關(guān)序列比對，并采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4.6 藥敏試驗。

采用常規(guī)方法對分離菌進行菌落計數(shù)[7]。將菌液密度稀釋至106 CFU/ml，應用微量稀釋法將11種藥物在無菌96孔培養(yǎng)板進行二倍梯度稀釋，將所有藥液濃度依次稀釋為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg/ml，再將菌液稀釋液加入96孔含有抗菌藥物的培養(yǎng)板內(nèi)，進行3次重復性試驗，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，對細菌生長狀況進行觀察。目前對于維氏氣單胞菌藥物敏感折點還沒有明確標準，所以參照動物源細菌抗菌藥物敏感性稀釋法進行判定和藥物敏感性分析[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體形態(tài)觀察 經(jīng)TSA瓊脂28 ℃ 24 h培養(yǎng)后，觀察的菌落形態(tài)為圓形黃色，不透明，表面光滑濕潤，扁平，菌落邊緣整齊。革蘭氏染色為陰性菌短桿狀，兩邊鈍圓（圖1）。

2.2 動物回歸試驗結(jié)果 感染組的黃河鯉出現(xiàn)與分離菌病魚相似的狀況，肛門出現(xiàn)紅腫，腹部及頭部出現(xiàn)出血， 2×109 CFU/ml劑量感染組7 d后全部死亡，而對照組并未出現(xiàn)發(fā)病和死亡（表1）。解剖死魚分離純化其脾臟內(nèi)細菌，經(jīng)生理生化反應鑒定與LP1401相同。這說明分離菌有較強的致病性。

2.3 生理生化試驗結(jié)果 由表2可知，分離菌LP1401革蘭氏染色為陰性菌主要的理化特性為葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣等，甘露醇、硫化氫和乳糖為陰性，參照伯杰氏細菌鑒定手冊[9]可初步鑒定LP1401是維氏氣單胞菌。

2.4 16S rDNA基因的PCR結(jié)果 提取分離菌LP1401的DNA，以其為模板進行PCR，擴增16S rDNA基因序列，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)其片段長度約為1 500 bp（圖2）。

2.5 系統(tǒng)進化分析 將分離菌PCR擴增16S rDNA基因序列，送至上海生物公司測序，經(jīng)過人工校對得到序列為1 450 bp。采用BLAST軟件進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)分離菌序列與多個在GenBank中已報道的維氏氣單胞菌序列相似度均為99%。與多個菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)分離株LP1401與維氏氣單胞菌（登錄號KM387283.1）為同一分支（圖3），進一步確定分離菌株為維氏氣單胞菌。

2.6 藥敏試驗結(jié)果 參考CLSI動物源細菌藥敏試驗標準[8]，分別以敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）和耐藥（Resistant，R）來判定菌株對藥物敏感情況。由表2可知，分離菌株對磺胺間甲嘧啶、阿莫西林、紅霉素、對慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素和環(huán)丙沙星7種藥物耐藥，對強力霉素中介，而對氟苯尼考、氯霉素和恩諾沙星4種藥物敏感。

3 討論

維氏氣單胞菌是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常見的條件性致病菌，其廣泛存在于水、淤泥和土壤中，可導致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量下降。同時，它也可感染人類導致腹瀉、膽道感染、肺炎、菌血癥等[10]，是一種致病性較強的人畜共患病原菌。近年來，維氏氣單胞菌感染范圍不斷增大，這使人們對其研究不斷加寬加深，從不同水產(chǎn)生物（如異育銀鯽魚（Carassius auratus gibelio）[1]、團頭魴（Megalobrama amblycephala）[2]、草

魚（Ctenopharyngodon idellus）[3]、中華絨螯蟹（Eriocheir Sinensis）[4]、斑點叉尾鮰（Channel catfish）[5]、羅非魚（Oreochromis mossambicus）[6]、齊口裂腹魚（Schizothorax prenati）[11]等）中分離、鑒定并進行藥敏感試驗。

筆者從黃河鯉脾臟中分離到1株優(yōu)勢菌LP1401，通過形態(tài)學觀察、革蘭氏染色、生理生化試驗初步確定為維氏氣單胞菌。其16S rDNA基因序列與GenBank中已報道的維氏氣單胞菌序列相同，進一步證明該菌為維氏氣單胞菌，并對其與不同氣單胞菌種屬構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)分離菌在維氏氣單胞菌分支上，說明此分離菌與維氏氣單胞菌親緣關(guān)系較近。純化菌經(jīng)人工感染可使黃河鯉死亡，說明該菌存在較強的致病性。近年來，病原菌的耐藥性不斷增強，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖類的臨床治療難度增大，該菌的MIC藥敏試驗結(jié)果表明其對磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物耐藥性較強，這與黃文明等[12]在胭脂魚（Myxocyprinus asiaticus）中分離的維氏氣單胞菌耐藥情況不盡相同，可能與魚類的品種和菌株來源不同有關(guān)。該菌對氯霉素、氟苯尼考和恩諾沙星仍較為敏感，與楊小強等[13]在金魚（Goldfish）中分離維氏氣單胞菌的敏感情況相同。這可能與東北地區(qū)氯霉素和氟苯尼考投入臨床使用時間較短使用頻率較低有關(guān)。該試驗結(jié)果可為研究鯉魚源維氏氣單胞菌分離鑒定及臨床選藥提供參考，但由于菌株的來源不同地域分布不同，治療時仍要進行相應菌株的測定有針對性地合理用藥。

安徽農(nóng)業(yè)科學 2015年

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