綠竹P5CS基因的擴(kuò)增及序列分析

鐘浩　高貴賓　潘雁紅　吳良如

摘要 采用同源克隆方法從綠竹基因組中獲得2個(gè)P5CS基因組片段：DoP5CS1長度為2 178 bp，包含7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子，外顯子編碼序列為976 bp，編碼325個(gè)氨基酸殘基，編碼蛋白分子量34.787 4 kD，等電點(diǎn)（PI）5.27，N端有一個(gè)氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能區(qū)，C端有一個(gè)醛脫氫酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能區(qū)；DoP5CS2大小與DoP5CS1外顯子序列相同為976 bp，相似性達(dá)99.6%，但缺失內(nèi)含子，推測(cè)DoP5CS2為返座假基因。該研究為基因全長序列的獲取和功能分析以及通過分子生物學(xué)手段提高綠竹乃至其他竹類植物的抗逆性奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 綠竹；P5CS；克?。桓彼?/p>

中圖分類號(hào) S188+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-025-05

竹子屬禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）多年生常綠植物，四季常青，枝葉茂盛，是極其重要的非木材可再生林業(yè)資源，是園林綠化的重要植物。竹子喜溫暖怕風(fēng)寒，喜濕潤怕干旱，喜肥，喜酸性怕堿性[1]。由于受各地氣溫的影響，大部分竹種在分布上具有明顯的地帶性和區(qū)域性，其中福建、江西、浙江和湖南4省為主要產(chǎn)區(qū)。竹子的栽培區(qū)域多集中在南方，雖然人們?cè)凇澳现癖币啤币N研究上作了大量工作，通過引種馴化，使一些竹種能夠在華北、西北等氣候較寒冷、干燥的地區(qū)生長，但溫度和水分一直是限制一些極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的竹種得不到進(jìn)一步推廣種植的主要因子[2]；而且引種后需要采取一系列行之有效的栽培技術(shù)措施來改善不良的環(huán)境條件，以滿足竹子的生長發(fā)育，但存在環(huán)境可控性差、生產(chǎn)成本較高和竹林生長不良等問題。如何利用現(xiàn)代生物技術(shù)改變竹子自身，如通過轉(zhuǎn)基因等分子生物學(xué)手段的處理，改變竹子的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，使其主動(dòng)適應(yīng)不良環(huán)境[3]，提高抗逆性，已成為竹類植物遺傳改良的必然選擇。

植物在適應(yīng)低溫、干旱等脅迫時(shí)，往往通過生理生化的變化來適應(yīng)，包括脅迫響應(yīng)的功能和基因調(diào)控[4]。如植物膜脂發(fā)生改變[5]、糖和脯氨酸含量增高[6-7]、蛋白質(zhì)組成發(fā)生變化[8]以及葉綠體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[9]等，其中脯氨酸（Proline）在滲透平衡中起著重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)細(xì)胞的膨壓增加有保護(hù)作用[10]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase， P5CS）是脯氨酸合成限速酶。P5CS基因全長cDNA序列已經(jīng)在許多植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、豇豆（Vigna aconitifolia）和鹽地堿蓬（Suaeda salsa）等被克隆并研究。而其基因組序列的研究較少，如在擬南芥基因組中克隆出P5CS基因序列（X86778），全長序列為5 789 bp，包含19個(gè)內(nèi)含子和20個(gè)外顯子；在甘蔗（Saccharum officinarum）基因組中克隆出2 016 bp的P5CS基因組片段（EF620362），包含7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子[11]。

筆者以經(jīng)長期進(jìn)化適應(yīng)比較抗寒的大型叢生竹種綠竹（Dendrocalamopsis oldhami）為試材，通過P5CS基因的擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析，旨在為今后該基因全長序列及其功能研究奠定基礎(chǔ)，為竹子遺傳轉(zhuǎn)化、抗寒新品種培育及抗逆分子育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料綠竹嫩葉采自福建華安竹種園，采集時(shí)經(jīng)變性硅膠快速干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

TA克隆載體pMD18-T Vector、Taq酶及PCR試劑購自TaKaRa公司，GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、氨芐抗生素、IPTG和X-Gal購自生工生物工程上海（股份）有限公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物

根據(jù)NCBI的GenBank與DDBJ數(shù)據(jù)庫中的P5CS基因比對(duì)結(jié)果中保守區(qū)的核苷酸序列[11]，采用生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0分析設(shè)計(jì)引物，引物長度20～22 bp，GC含量45%，退火溫度53 ℃。引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，序列

F1：5′-GATTCATCTGGTATATCCTGGG-3′；

R1：5′-TTACTCCCTCTTGGAATGAC-3′。

1.4 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法提取綠竹基因組DNA[12]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，取1 μl在1%TAE瓊脂糖凝膠上檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后定量至100 ng/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 P5CS基因序列擴(kuò)增與測(cè)序

上述基因組DNA 1 μl，10×PCR Buffer 2 μl，MgCl2 1.2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，Taq酶0.1 μl，加ddH2O至20 μl后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，

53 ℃延伸30 s，72 ℃退火2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化和菌液PCR檢測(cè)后，將陽性克隆的菌液送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.6 序列分析

將測(cè)序獲得的序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列用blastn程序進(jìn)行相似性比對(duì)；利用Vector NTI 11.5.1軟件選取Clustal W方法對(duì)確定的P5CS基因序列與甘蔗ScP5CS基因（EF620362）進(jìn)行比對(duì)；利用DNAMAN軟件和http：//www.bio-soft.net/sms/index.html在線分析軟件預(yù)測(cè)編碼序列；通過NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)氨基酸序列進(jìn)行保守域檢索。

43卷19期 鐘 浩等 綠竹P5CS基因的擴(kuò)增及序列分析

2 結(jié)果與分析

2.1 綠竹P5CS基因序列克隆

由圖1可知，從綠竹基因組DNA中擴(kuò)增出2條清晰的條帶，分別為2 kb和1 kb左右。產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，將獲得的陽性克隆送上

海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別為2 178和976 bp，經(jīng)blastn程序相似性比對(duì)，確定為P5CS基因序列，命名為DoP5CS1和DoP5CS2。

2.2 綠竹DoP5CS基因片段核苷酸序列分析

通過分析可知，DoP5CS1包含7個(gè)內(nèi)含子，大小分別為465、132、168、156、118、93和70 bp（圖2），其中976 bp為外顯子編碼序列。

將DoP5CS2（圖3）與DoP5CS1的外顯子序列進(jìn)行同源性分析，大小與外顯子序列一致，只是有4個(gè)堿基的差異，相似性達(dá)99.6%，缺失了DoP5CS1的內(nèi)含子（圖4），推測(cè)DoP5CS2為返座假基因序列。

將DoP5CS1與甘蔗ScP5CS基因片段（EF620362）進(jìn)行比對(duì)（圖5），結(jié)果顯示相似性為78%。

2.3 綠竹DoP5CS基因片段預(yù)測(cè)的氨基酸序列分析

將DoP5CS1的外顯子與甘蔗ScP5CS基因片段的外顯子（EF620362.1 GI：149900513）進(jìn)行比對(duì)（圖6），相似性為87%，但發(fā)現(xiàn)缺失了一個(gè)堿基（圖中箭頭所示），這可能是由于PCR擴(kuò)增或測(cè)序時(shí)出錯(cuò)導(dǎo)致的。

鑒于堿基缺失會(huì)導(dǎo)致讀碼框位移，在此以977 bp對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖7），共編碼325個(gè)氨基酸殘基，分子量34.787 4 kD，等電點(diǎn)（PI）5.27。

分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，具有P5CS共有的結(jié)構(gòu)域[11]：Putative leucine domain； Glutamate-5-kinase domain； Putative NADPH-binding domain保守區(qū)。

將預(yù)測(cè)的綠竹DoP5CS1基因氨基酸序列與甘蔗ScP5CS基因氨基酸序列（ABR32187）進(jìn)行同源性分析（圖8），發(fā)現(xiàn)相似性為90%。

將預(yù)測(cè)的綠竹DoP5CS1基因氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保守域檢索（圖9），結(jié)果顯示其N端有一個(gè)氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能區(qū)，C端有一個(gè)醛脫氫酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能區(qū)。

3 討論

該研究克隆獲得的DoP5CS1片段包含7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子，而DoP5CS2片段具有大多數(shù)返座假基因鮮明特征：完全缺失存在于功能基因中的間隔序列，即內(nèi)含子序列[13]。因此，推測(cè)DoP5CS2片段可能為返座假基因。

在生物的演變進(jìn)程中，基因序列在復(fù)制過程中不斷發(fā)生各種變化，包括突變、漂移、插入和缺失等，這些變化有可能導(dǎo)致其失去編碼功能，成為假基因[14]。Makalowski[15]認(rèn)為這些基因片段與它們鄰近的基因相互作用而影響生物的進(jìn)化。該研究從綠竹基因組中獲得了P5CS基因的返座假基因片段，說明綠竹與其他植物一樣，在其長期進(jìn)化過程中由于突變等原因產(chǎn)生一些基因片段，這些基因片段與其功能基因相互作用影響綠竹的遺傳多樣性。

通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，獲得的綠竹DoP5CS1基因與其他植物的P5CS基因一樣，均有共同的NADPH的結(jié)合位點(diǎn)，這與馬麗清[16]的研究結(jié)果一致。

該研究獲得的綠竹DoP5CS1基因片段的結(jié)構(gòu)信息，為該基因全長序列的獲取及其功能研究奠定基礎(chǔ)；也為研究綠竹脯氨酸合成酶系基因及通過分子生物學(xué)手段提高綠竹乃至其他竹類植物的抗逆性提供了線索。

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