花生短體線蟲病的病原鑒定與診斷

章淑玲　廖琳琳　劉國坤　肖順　張紹升

摘 要 2013年對福建省3個花生產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)成熟的花生莢果果面上出現(xiàn)紫褐至黑色病斑，病斑病健交界處清晰，花生的根和胚栓也出現(xiàn)不同程度的變色壞死癥狀。同時采集病變樣品，從各病組織中分離出大量的短體線蟲，其中以花生外殼組織中的線蟲最多。該線蟲通過形態(tài)學(xué)特征觀察和分子生物學(xué)特性比較，鑒定為短尾短體線蟲（Pratylenchus brachyurus）。再對短尾短體線蟲侵染花生引起的病害癥狀進(jìn)行詳細(xì)描述，并通過接種試驗證實短尾短體線蟲對中國花生的致病性。

關(guān)鍵詞 花生；短尾短體線蟲；癥狀；致病性

中圖分類號 S435 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

花生（Arachis hypogaea L.）是中國重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物，其年產(chǎn)量約占世界的1/3[1-2]?；ㄉ€蟲病是花生生產(chǎn)上的一類重要病害。全世界已報道對花生經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量有較大影響的線蟲有根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）、短尾短體線蟲（Pratylenchus brachyurus）、長尾刺線蟲（Belonolaimus longicaudatus）、裝飾小環(huán)線蟲（Criconemella ornata）、花生種皮滑刃線蟲（Aphelenchoides arachidis）、非洲莖線蟲（Ditylenchus africanus）[3-7]及中國新報道的花生莖線蟲（D. arachis）[8]。其中花生短尾短體線蟲于1942年在美國的阿拉巴馬州首次發(fā)現(xiàn)，隨后在美國的大多數(shù)花生種植區(qū)及埃及、澳大利亞、津巴布韋也相繼有報道，主要侵染花生的根、胚栓和莢果，其中以成熟的莢果受害最重[3]。短尾短體線蟲在中國已報道，可寄生為害菠蘿（Ananas comosus）、茶樹（Camellia sinensis）、象草（Pennisetum purpureum）、大豆（Glycine max）、甘薯（Ipomoea batatas）、番石榴（Psidium guajava）及從臺灣引境的春蘭（Cymbidium goeringii）等植物[9-15]，在花生上雖有過記述但未見詳細(xì)的危害報道[16]。2013年作者在福建省廈門市和寧德市3個花生種植區(qū)發(fā)現(xiàn)花生的根、胚栓及莢果發(fā)生明顯病變，并從受害組織中分離出大量短體線蟲。本研究對福建花生短體線蟲病的癥狀特點和病原種類進(jìn)行了分析，以其為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 2013年8月從福建省廈門市翔新圩鎮(zhèn)、新店鎮(zhèn)及寧德市霞浦縣的3個花生種植區(qū)采回受害花生的根、根際土壤和病果莢。分離出的線蟲用胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)作為致病性接種材料[17]。

1.1.2 儀器和試劑 TAF（三乙醇胺福爾馬林固定液）；DNA提取液；通用引物；Leica DM6000顯微鏡；日立TM-1000掃描電鏡。

1.2 方法

1.2.1 線蟲的分離 果莢線蟲分離采用直接解剖法，根組織內(nèi)和土壤中的線蟲用漏斗法分離[16]。

1.2.2 癥狀觀察和病組織染色 肉眼觀察受害植株各部位的癥狀特點，并通過病組織染色法觀察線蟲侵染的內(nèi)部癥狀及接種試驗對花生的致病性。病組織染色法參照Bybd等[18]。

1.2.3 線蟲的鑒定

（1）顯微形態(tài)鑒定。分離的線蟲樣本經(jīng)60 ℃溫?zé)釟⑺篮螅訲AF為浮載劑，用Leica DM6000顯微鏡對線蟲形態(tài)特征進(jìn)行觀察和度量，形態(tài)計量采用De Man公式[16]。文中a=體長/最大體寬，b=體長/頭端至食道與腸連接處的距離，b′=體長/頭端至食道末端的距離，c=體長/尾長，c′=尾長/肛門處體寬，V=陰門至頭頂距離×100/體長。唇區(qū)細(xì)微結(jié)構(gòu)采用日立TM-1000掃描電鏡進(jìn)行觀察，線蟲掃描電鏡標(biāo)本制作方法采用戊二醛-鋨酸雙固定及臨界點干燥法[19]。

（2）分子鑒定。線蟲DNA的提取參照Liu等[20]的方法。ITS區(qū)擴(kuò)增：采用50 μL反應(yīng)體系，包括25 μL PCR Master Mixture，2 μL DNA模板，上、下游引物各1.0 μL（10 mmol/L），21 μL ddH2O。通用引物：TW81（5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′）和AB28（5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′）[21]。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。

D2D3區(qū)擴(kuò)增：用于擴(kuò)增線蟲28S rDNA的D2D3區(qū)引物為通用引物：D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGG

GAAAGTTG-3′）和D3B（5′-TCGGAAGGAACCAGCTA

CTA-3′）[22]。PCR反應(yīng)體系和程序同上。

反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μL加樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳，用0.5×TBE作為電泳緩沖液，100 V下電泳30 min，用EB染色，電泳結(jié)果用全自動凝膠成像儀觀察、拍照。

（3）序列測定與分析。PCR產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行回收、克隆、測序，測定的序列用BLAST、DNAMAN軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 致病性測定 將經(jīng)過180 ℃高溫滅菌的土壤裝入直徑25 cm的塑料栽培盆內(nèi)。選用當(dāng)?shù)責(zé)o病健康的花生種子經(jīng)干凈清水浸種12 h后播植于栽培盆內(nèi)的滅菌土壤中?；ㄉ雒? d后，每盆選留1株花生苗并于根部接種經(jīng)胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)的含各齡短體線蟲懸浮液（500條左右）。以不接線蟲為對照。每種處理10盆，栽培120 d后即花生成熟期觀察植株各部位的癥狀，并分離各部位的線蟲。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

受短體線蟲為害后的花生植株地上部無明顯的特異性表現(xiàn)，地下部主要表現(xiàn)為根部固氮根瘤菌及結(jié)莢數(shù)明顯減少，根皮層、胚栓及莢果均有不同程度的變色壞死（圖1-A、B）。受害后的莢果較健康的莢果顏色暗，果面上出現(xiàn)近圓形至不規(guī)則形的褐色斑塊，而后病斑逐漸變大或愈合成塊，病斑則變成紫褐色至黑色，病斑病健交界處清晰（圖1-C、D）。由于外殼受損，感病的花生外種皮較正常種皮?，F(xiàn)不規(guī)則的黃褐色病斑（圖1-F）。經(jīng)分離及組織染色法檢查顯示，該線蟲可侵染花生的根、胚栓及果莢，但在種皮、胚芽及子葉上則未檢測到線蟲。該線蟲寄生在根和胚栓上的蟲量較少（圖1-G、H），大量存在于成熟的果莢上，在一個成熟的果莢中常含有數(shù)百條各期蟲態(tài)的短體線蟲（圖1-I）。

2.2 病原線蟲鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 形態(tài)測量值具體見表1。

雌蟲蟲體粗壯，經(jīng)60 ℃溫?zé)釟⑺篮笙x體直伸或稍向腹面彎曲（圖2-A），體環(huán)明顯。頭部低平，唇環(huán)2個（圖2-H），頭部與蟲體不連續(xù)，邊緣有較明顯的棱角（圖2-C）。唇正面有6個唇片，2個側(cè)唇片位于唇盤中部兩側(cè)，4個近圓形亞中唇片排列于亞腹側(cè)和亞背側(cè)，側(cè)器口位于側(cè)唇片（圖2-I、J）?？卺槾謮眩壳驁A球形、特別發(fā)達(dá)，不向前、后傾斜（圖2-C）。背食道腺開口距口針基部球約為2～4 μm；中食道球卵圓形，發(fā)育良好，瓣門明顯；食道腺覆蓋在腸的側(cè)腹面；排泄孔位于神經(jīng)環(huán)后、食道腺葉與腸連接處前；半月體緊鄰排泄孔之前，3個體環(huán)長（圖2-B）。側(cè)區(qū)有側(cè)線4條，從前體部約5～6個體環(huán)處開始，一直延伸到蟲體末端，側(cè)區(qū)約為體寬的四分之一，側(cè)區(qū)偶爾有1至2條縱線或斜紋、或中間的兩條側(cè)線呈不連續(xù)的斜紋（圖2-D）。單生殖腺前伸，卵母細(xì)胞單行排列，受精囊不明顯，未見精子；陰門橫裂，占3～4個體環(huán)，位于蟲體后部85%左右的位置；后陰子宮囊長度不超過陰門處體寬；陰肛距約為尾部長度的2倍（圖2-E）。尾圓錐形，尾末端寬圓，光滑、無環(huán)紋；尾端部角質(zhì)層增厚；側(cè)尾腺開口在尾部中間；尾腹環(huán)17～20個（圖2-F、G ）。

未檢測到雄蟲。

根椐線蟲形態(tài)特征觀察和測量值比對，侵染花生的短體線蟲種鑒定為短尾短體線蟲（Pratylenchus brachyurus）[23]。

2.2.2 分子鑒定 （1）ITS序列分析。ITS序列測定結(jié)果表明，分別獲得了675 bp和707 bp 2種不同長度的序列，其中廈門翔安新圩鎮(zhèn)種群和寧德霞浦種群為675 bp（GenBank登錄號分別為KF712470和KF712471），而廈門翔安新店鎮(zhèn)種群為707 bp（GenBank登錄號為KF537388）。BLAST及DNAMAN分析表明，這3個分離物與已知的短尾短體線蟲17個分離物序列具有最高的序列同源性，同源性在92.3%～100%之間。其中，廈門翔安翔安新店鎮(zhèn)種群（KF537388）與已知的短尾短體線蟲序列同源性在93.0%～100.0%之間；寧德霞浦種群（KF712470）與已知序列同源性在92.3%～95.1%之間；廈門翔安新圩鎮(zhèn)種群（KF712471）同源性在91.3%～95.5%之間。

（2）28S rDNA-D2D3區(qū)序列分析。D2D3序列測序后也獲得了廈門翔安新圩鎮(zhèn)種群780 bp（KF712474）、翔安新店鎮(zhèn)種群778 bp（KF712472）和寧德霞浦種群781 bp（KF712473）。序列分析表明，這3個分離物同樣與已知的短尾短體線蟲15個分離物具有最高的序列同源性。其中， KF712472與已知的短尾短體線蟲序列同源性在95.5%～97.1%之間； KF712473與已知序列同源性在96.8%～ 98.7%之間；KF712474的同源性在96.4%～98.3%之間。

2.3 致病性測定

栽培120 d后拔出植株可見接種短體線蟲的花生地下部較未接種線蟲植株的固氮根瘤菌減少（圖3-A、B），根系、胚栓及莢果上出現(xiàn)小的或愈合成塊的紫褐或黑褐色病斑（圖3-B～D），剖開果殼可見花生外種皮中靠近胚根處呈現(xiàn)出不規(guī)則的黃褐色病斑黃褐色（圖3-E），其癥狀與田間自然發(fā)病植株的癥狀一致。同時可從發(fā)病的根、胚栓及莢果中可分離出數(shù)量不一的各期蟲態(tài)的短尾短體線蟲，以果莢處分離的蟲量最多。而對照植株的根及莢果無一發(fā)病。接種試驗證明，短尾短體線蟲是引起花生根系、胚栓、莢果及種皮變色、腐爛的病原。

3 討論與結(jié)論

本研究通過調(diào)查及致病性接種試驗，首次發(fā)現(xiàn)短尾短體線蟲可對福建花生造成危害并詳細(xì)地描述了其癥狀特點，其中以受害的成熟莢果果面上易出現(xiàn)紫褐至黑色病斑且病健交界清晰為該線蟲在花生上引起的典型癥狀。對該病原線蟲進(jìn)行形態(tài)測量與觀察，其測量值和形態(tài)特征與短尾短體線蟲的原始描述相符[23]，種的主要鑒定特征是：側(cè)區(qū)有側(cè)線4條，口針粗壯，基部球圓球形、發(fā)達(dá)；受精囊不明顯，未見精子；尾部圓錐形，末端寬圓、光滑、無環(huán)紋；尾端部角質(zhì)層增厚[23]。

在分子鑒定中福建3個地理種群的花生短尾短體線蟲rDNA-ITS序列與已知短尾短體線蟲的17個分離物相比同源性最高，同源性在92.3%～100%之間，但種內(nèi)差異顯著，這與以往報道的短體線蟲ITS種內(nèi)變異較大描述相符[14，24]；相比ITS區(qū)，本研究3個種群線蟲28S rDNA-D2D3區(qū)內(nèi)種內(nèi)變異較小，同源性在95.5%～98.7%，并能顯著將短尾短體線蟲與屬內(nèi)其他短體線蟲區(qū)分開來。 因此，短體線蟲28S rDNA-D2D3區(qū)序列更適合作為短體線蟲的種類鑒定依據(jù)。

短尾短體線蟲寄主范圍廣且危害性大[3，9-15，23]，目前在中國花生生產(chǎn)中的危害尚未引起相應(yīng)的關(guān)注，故今后將進(jìn)一步加強(qiáng)對花生短尾短體線蟲在福建省及中國花生主要產(chǎn)區(qū)的發(fā)生及為害調(diào)查，制定相應(yīng)的措施降低其危害，以防止病害的進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。

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