7株拮抗菌的鑒定及其對(duì)香蕉炭疽病的防治作用

付崗　葉云峰　吳永官　杜嬋娟　晏衛(wèi)紅　潘連富

摘 要 為了收集利用香蕉炭疽病的生防菌資源和評(píng)價(jià)拮抗菌的防病能力，通過培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)和16S rRNA序列特征分析等方法對(duì)篩選到的7株拮抗菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其防病作用進(jìn)行了初步測(cè)試。結(jié)果表明：菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911為短短芽孢桿菌，菌株Bc6301為蠟狀芽孢桿菌。人工接種結(jié)果表明，菌株Bc6301對(duì)香蕉炭疽病的防效最高，為45.94%，其余6株拮抗菌的防效在22.35%～43.29%。

關(guān)鍵詞 芭蕉炭疽菌；短短芽孢桿菌；蠟狀芽孢桿菌

中圖分類號(hào) S436.67 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

香蕉炭疽病由芭蕉炭疽菌[Colletotrichum musae（Berk. & Curt.）Arx]引起，是香蕉儲(chǔ)運(yùn)過程中發(fā)生最為嚴(yán)重的病害之一[1]。由于重視程度不同和防治手段差異，由香蕉炭疽病導(dǎo)致的損失在20%～40%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%以上[2-3]。目前香蕉炭疽病的防治主要還是依靠化學(xué)藥劑，異菌脲、咪鮮胺、噻菌靈等生產(chǎn)上最常用的化學(xué)殺菌劑，由此帶來的農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為中國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因素之一[4-5]。另外，由于長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥促使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，人們?cè)絹碓街匾晫で筢槍?duì)香蕉炭疽病的非化學(xué)防治途徑。

由于香蕉在采后儲(chǔ)運(yùn)期間所處的環(huán)境條件相對(duì)較為穩(wěn)定，這給拮抗微生物的利用提供了有利條件。許多不同種類的拮抗菌被篩選用于防治香蕉炭疽病，其中以芽孢桿菌類（Bacillus sp.）細(xì)菌較為常見[6]?？莶菅挎邨U菌（B. subtillis）是最常見的香蕉炭疽病拮抗菌[7-9]。此外，也有利用解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）等防治該病的報(bào)道[10]。雖然研究者們已篩選到相當(dāng)數(shù)量的拮抗微生物，但目前這些菌株尚未能應(yīng)用于生產(chǎn)。作者在前期研究中從廣西南寧不同作物根圍獲得的997株分離物中篩選到7株對(duì)香蕉炭疽病菌有較強(qiáng)抑菌作用的拮抗菌株，本文通過形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)試結(jié)合16S rRNA序列特征分析對(duì)這7株拮抗菌進(jìn)行鑒定，并評(píng)價(jià)其對(duì)香蕉炭疽病的防治作用，旨在為香蕉炭疽病的生物防治提供新的菌種資源和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）Cm1和7株拮抗菌Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004、Bb5911和Bc6301菌株均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所生物防治研究室提供。

供試香蕉：品種威廉斯（Musa AAA Cavendish var.Williams），采自廣西隆安縣丁當(dāng)鎮(zhèn)香蕉園，采收前2個(gè)月內(nèi)未噴施殺菌劑。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[5]和NA培養(yǎng)基[7]，分別用于培養(yǎng)香蕉炭疽病菌和拮抗菌。

分子生物學(xué)試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司；Taq酶和dNTP購(gòu)自北京百川開泰生物科技有限公司生產(chǎn)；引物F27和R1492由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株的形態(tài)和生理生化特征 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《一般細(xì)菌常用鑒定方法》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》觀察各菌株的培養(yǎng)形態(tài)、性狀、鞭毛和芽孢、革蘭氏染色，測(cè)定菌株的生理生化特征，觀察不同pH值、溫度條件下菌株的生長(zhǎng)狀況及耐鹽性[11-13]。

1.2.2 拮抗菌的16S rRNA序列分析 參照說明書用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各拮抗菌株的DNA。采用細(xì)菌16S rRNA通用擴(kuò)增引物Primer F27（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和Primer R1492（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序參照Fu等[7]的研究方法。

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)后送上海生工生物公司，用引物Primer F27和R1492進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并利用Mega 6.06軟件采用鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 拮抗菌對(duì)香蕉炭疽病的防治效果 7株拮抗菌分別接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃下 150 r/min搖床培養(yǎng)3 d，得到OD625=0.8的菌體發(fā)酵液。制備香蕉炭疽病菌孢子液濃度為104個(gè)/mL，備用。

田間采收八成熟的蕉果，去除傷病蕉果，將自然梳分成單個(gè)蕉指，抹去花器，洗凈晾干。蕉果在拮抗菌發(fā)酵液的10倍稀釋液中浸泡10 min后取出，室溫下晾干，以清水為對(duì)照。24 h后用Cm1孢子懸浮液對(duì)蕉果進(jìn)行噴霧接種。再次晾干后，用厚度0.04 mm的聚乙烯袋密封包裝，然后放入紙箱，于27 ℃下，RH 78%放置貯藏。每個(gè)拮抗菌株3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)8個(gè)蕉果。

共進(jìn)行2次病情調(diào)查，實(shí)驗(yàn)香蕉始發(fā)病時(shí)進(jìn)行第1次調(diào)查，香蕉完全成熟后進(jìn)行第2次調(diào)查；參照Fu等的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分級(jí)[7]。拮抗菌對(duì)香蕉炭疽病的防治效果的計(jì)算公式為：病情指數(shù)=[100×∑（各級(jí)病果數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）]/（調(diào)查總果數(shù)×9）；防治效果/%=100×（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)。

1.2.4 拮抗菌株Bc6301對(duì)香蕉炭疽病菌的抑制作用

按1.2.3方法制備Bc6301的菌體發(fā)酵液和香蕉炭疽病菌Cm1菌株的孢子液。將拮抗菌發(fā)酵液通過0.22 μm細(xì)菌過濾器獲得無(wú)菌濾液，與Cm1菌株孢子液等量混合后，置凹玻片28 ℃共培養(yǎng)。以等量無(wú)菌水與Cm1孢子液混合為對(duì)照，24 h后鏡檢病菌孢子生長(zhǎng)萌發(fā)情況。每次隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)可見的所有孢子，芽管長(zhǎng)度大于孢子長(zhǎng)度1/2的計(jì)為孢子萌發(fā)。每處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SAS9.0軟件進(jìn)行分析，采用Duncan's新復(fù)極差法比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

拮抗菌在NA平板上培養(yǎng)16 h后，陸續(xù)出現(xiàn)單菌落。菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911的形態(tài)特征較為一致，單菌落為圓形、有光澤、不透明，中間隆起，邊緣整齊（圖1-A）。電子顯微鏡下可見菌體呈短桿狀，產(chǎn)芽孢，具周生鞭毛（圖1-B）。

菌株Bc6301的單菌落乳白色、粘稠厚重、半透明、濕潤(rùn)光亮，表面似毛玻璃或蠟狀（圖1-C）。菌體呈桿狀，鞭毛周生較稀疏（圖1-D）。

2.2 菌株的生理生化特征

7株拮抗菌的生理生化反應(yīng)測(cè)試結(jié)果見表1。Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911等6菌株的測(cè)試反應(yīng)結(jié)果類似，其中12項(xiàng)生理生化測(cè)試及其生長(zhǎng)溫度和pH值測(cè)試結(jié)果完全一致，并與細(xì)菌分類學(xué)專著[11-13]中對(duì)短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的描述相符。B. brevis的硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用和2% NaCl生長(zhǎng)這3項(xiàng)測(cè)試反應(yīng)在《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的描述為結(jié)果可變。表1的結(jié)果顯示，以上6株拮抗菌之間在這3項(xiàng)反應(yīng)上確有細(xì)微差異。

與前述6株拮抗菌相比，菌株Bc6301的生理生化反應(yīng)結(jié)果差異較大。如，在V-P反應(yīng)、硫化氫產(chǎn)生、淀粉水解、卵磷脂酶、厭氧生長(zhǎng)等方面都呈現(xiàn)不同反應(yīng)。根據(jù)各菌株的生理生化反應(yīng)結(jié)合其形態(tài)特征，參照細(xì)菌分類學(xué)專著[11-13]，可初步確定菌株Bc6301為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.3 菌株的16S rRNA序列特征

經(jīng)基因組DNA提取，對(duì)7株拮抗菌的16S rRNA區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到大小約1.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。7份PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分別得到1 402～1 459 bp的堿基序列，所有序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并獲得了各自的登錄號(hào)，結(jié)果如表2所示。各序列與GenBank中已有序列的Blast比對(duì)結(jié)果顯示，菌株Bc6301與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）的16S rRNA序列的同源性最高，達(dá)100%；其余6菌株的相應(yīng)序列均與短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的同源性最高，為99%。

以Agrobacterium rhizogenes（FJ527681）為外群，構(gòu)建了菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004、Bb5911與相關(guān)24個(gè)細(xì)菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，這6株拮抗菌與其它4株短短芽孢桿菌（EU771078、GQ375794、EF488102、AY591911）共同聚集在同一個(gè)小的分支內(nèi)，包括這個(gè)分支在內(nèi)的所有短芽孢桿菌屬的菌株均處于同一個(gè)大的分支中。而芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的菌株（EU257435）處于距離較遠(yuǎn)的分支。說明這6株拮抗菌與短芽孢桿菌屬的短短芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近（圖2）。

以Xanthomonas cynarae（AF208315）為外群，構(gòu)建的菌株Bc6301與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中21個(gè)相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。從圖中可以看出，菌株Bc6301與所有芽孢桿菌屬的細(xì)菌處于同一個(gè)大的分支，并與3株蠟狀芽孢桿菌（HM026606、FJ908707、GU812900）處于同一個(gè)較小分支內(nèi)，顯示菌株Bc6301與蠟狀芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近。

2.4 拮抗菌對(duì)香蕉炭疽病的防治效果

7株拮抗菌對(duì)香蕉炭疽病的防治效果見表3。香蕉貯藏16 d開始發(fā)病，各處理病情指數(shù)在15.42～26.78；從防效看，蠟狀芽孢桿菌Bc6301的防效最高，為71.24%，6株短短芽孢桿菌的防效在50.06%～65.74%。貯藏至19 d香蕉完全成熟，各處理區(qū)的病情指數(shù)均有增長(zhǎng)，防效均有所降低，但Bc6301菌株的防效（68.24%）仍明顯高與其它菌株。6株短短芽孢桿菌防效最高者為菌株Bb7802和Bb7304，分別為63.72%和61.59%。

2.5 拮抗菌Bc6301對(duì)香蕉炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

鏡檢可見菌株Bc6301對(duì)香蕉炭疽病菌的孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。清水對(duì)照的病菌孢子萌發(fā)率可達(dá)84.4%，而經(jīng)拮抗菌發(fā)酵液處理的病菌孢子萌發(fā)率僅為36.8%，并且孢子芽管較短。但未觀察到孢子畸形或原生質(zhì)泄露現(xiàn)象（圖4）。

3 討論與結(jié)論

通過對(duì)各菌株的形態(tài)觀察和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，參照分類學(xué)專著并結(jié)合菌株16S rRNA序列特征的分析，將6株拮抗菌Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），將菌株Bc6301鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

短短芽孢桿菌作為其它植物病害生防菌的研究國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)報(bào)道，其防治對(duì)象有煙草青枯病[14]、柑橘炭疽病[15]、萵苣菌核病[16]、草莓灰霉病[17]、番茄枯萎病[18]、黃瓜枯萎病[19]、瓜類枯萎病[20]、蔬菜猝倒病[21]和棉花枯黃萎病[22]等，但至今尚未見利用短短芽孢桿菌防治香蕉炭疽病的報(bào)道。

蠟狀芽孢桿菌作為植物病害生防菌已報(bào)道的防治對(duì)象有棉花黃萎病[23]、黃瓜枯萎病[24]、草莓白粉病[25]、小麥全蝕病[26]、植物青枯病[27]等。但未見蠟狀芽孢桿菌用于防治香蕉炭疽病。本研究進(jìn)一步擴(kuò)展了短短芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌作為生防菌的抗病譜，也進(jìn)一步擴(kuò)充了香蕉炭疽病生防菌的資源庫(kù)，為下一步香蕉炭疽病的生物防治提供了菌種材料。

對(duì)香蕉炭疽病的防效測(cè)試結(jié)果表明，香蕉貯藏16 d，7株拮抗菌的最高防效為71.24%，至蕉果完全成熟時(shí)，仍有3株拮抗菌的防效在61.59%以上。本研究中拮抗菌的培養(yǎng)是按照普通細(xì)菌的培養(yǎng)方式進(jìn)行，而實(shí)際上，若針對(duì)某一特定的拮抗菌株采用與之相適應(yīng)的最佳培養(yǎng)條件，并輔以合適的助劑，其防病效果還將有所提升。也就是說這些拮抗菌仍存在較大的生防潛能有待開發(fā)，這也是今后需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

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