甘蔗褐條病病原菌分離鑒定及其室內(nèi)毒力的測定

錢雙宏　沈林波　熊國如　王俊剛　馮翠蓮　趙婷婷　張樹珍

摘 要 針對海南省不同植蔗區(qū)甘蔗褐條病的典型病斑進行分離培養(yǎng)、單孢純化、形態(tài)學觀察、致病性檢測以及結(jié)合rDNA-ITS序列分析鑒定病原菌。分離到的5株病原菌，經(jīng)回接實驗表明，病原菌HT-4致病性最強，能引起與田間病害一致的癥狀，將菌株HT-4的rDNA-ITS序列在NCBI上進行BLAST比對。結(jié)果表明：菌株HT-4與離蠕孢屬（Bipolaris）相似性達到99%，結(jié)合形態(tài)學分析確定該菌是甘蔗褐條病的病原菌。室內(nèi)毒力實驗表明：在7種供試藥劑中，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡种菩Ч詈?，EC50值分別為4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L。結(jié)果為甘蔗褐條病的防控提供科學參考。

關(guān)鍵詞 甘蔗褐條病；離蠕孢屬；室內(nèi)毒力測定；殺菌劑

中圖分類號 S435.661 文獻標識碼 A

世界上已知甘蔗病害有130多種，國內(nèi)記載有60多種，其中，侵染性病害包括真菌性病害29種，細菌性病害5種，病毒和植原體病害8種，線蟲病害8種，寄生性植物2種，其余為非侵染性病害[1-2]。甘蔗褐條病是為害甘蔗葉片的一種真菌性病害[3]。其病原菌的有性階段為子囊菌門旋孢腔菌屬狹斑旋孢腔菌[Cochliobolus stenospilus（Drechs）Mats et Yam.]，目前甘蔗褐條病的有性階段僅在人工培養(yǎng)基或少數(shù)地方（如中國臺灣）發(fā)現(xiàn)過[4]；無性階段為半知菌類離蠕孢屬甘蔗狹斑離蠕孢菌[Bipolaris stenospila（Drechs）Shoemaker（=Helminthosporilum stenospilum Drechsler.）][5]。甘蔗褐條病于1924年首次在古巴發(fā)現(xiàn)[6]，至今已有許多國家都有此病害發(fā)生的報道。在中國各地蔗區(qū)如海南、廣東、廣西、云南、江西、福建、四川等?。ㄗ灾螀^(qū)）目前均有發(fā)生[5，7]。據(jù)報道，1975年曾在海南省定安縣龍門坡發(fā)生了較嚴重的褐條病，感病蔗株葉片早枯、植株矮小，甘蔗正常生長受到影響[6]。前人關(guān)于甘蔗褐條病在各植蔗區(qū)流行與防治、病原菌分類以及其致病毒素等方面的研究已有相關(guān)報道[8-13]。迄今，中國對甘蔗褐條病研究還較少，主要局限在病害發(fā)生原因、特點及防治措施的研究，而關(guān)于甘蔗褐條病病原菌鑒定還未見報道。近年來由于單一甘蔗品種的大面積連作種植，缺乏相應(yīng)的抗病品種，導(dǎo)致甘蔗褐條病頻發(fā)和大面積爆發(fā)，影響甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，本研究通過對甘蔗褐條病進行分離鑒定及對其進行殺菌劑室內(nèi)毒力的測定，擬為甘蔗褐條病病害防治策略制定以及進一步培育甘蔗抗病品種提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘蔗病害樣本分別取自海南省?？凇⑴R高、澄邁、文昌、屯昌、白沙、昌江和定安等植蔗區(qū)，取生長健壯的甘蔗植株在實驗室大棚中盆栽待用。

供試藥劑：50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（江門市大光明農(nóng)化有限公司）；70%代森錳鋅可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；50%多菌靈可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化股份有限公司）；75%百菌清可濕性粉劑（上海亞泰農(nóng)資有限公司）；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（江蘇龍燈化學有限公司）；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（瑞士先正達作物保護有限公司）；65%代森鋅可濕性粉劑（上?；莨饣瘜W有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 用常規(guī)組織分離法[14]分離病原菌。從蔗區(qū)采集表現(xiàn)甘蔗褐條病典型癥狀的新鮮病葉，用自來水沖洗干凈葉片表面，晾干。將病健交界處用手術(shù)刀片切成小塊病組織（0.5 cm2），然后在超凈工作臺中，用70%酒精浸泡20 s，0.1%的升汞溶液中消毒1 min，然后用無菌水清洗3次，置于無菌的濾紙上晾干。將病組織塊放入含氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。

待菌落長出后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)。產(chǎn)孢后進行單孢純化[15]，觀察形態(tài)特征并根據(jù)孢子形態(tài)進行鑒定。

1.2.2 病原菌致病性鑒定 將單孢菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長出孢子后，用無菌水制成孢子懸浮液，將其稀釋成孢子濃度為1×106個/mL。采用噴霧法，對健康甘蔗葉片接種（噴無菌水作為對照），套袋保濕24 h，10 d后觀察其發(fā)病癥狀是否與田間癥狀一致，并從發(fā)病部位進行病原菌分離，觀察孢子的形態(tài)特征與原分離菌株的形態(tài)特征是否相同。

1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 參照陳吉良等[16]的方法快速高效提取病原菌DNA。引物為真菌通用引物ITS1和ITS4。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：10×PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 1.6 μL，ITS1和ITS4各1 μL，DNA模板1.5 uL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，并進行連接轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果用BLAST軟件進行同源性比對，并用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 室內(nèi)毒力的測定 采用菌絲生長速率測定法[17-18]，測定7種農(nóng)藥對甘蔗褐條病病原菌的毒力。7種農(nóng)藥藥劑都配制成10 g/L的母液，然后分別用無菌水在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上配置成5個濃度梯度的藥液，將每種藥劑不同稀釋度的藥液分別加入冷卻至60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，制成含藥平板，以無菌水為對照。將甘蔗褐條病病原菌在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)6 d。用滅菌的打孔器（內(nèi)徑6 mm）在培養(yǎng)好的褐條病菌菌落邊緣打取菌餅。將菌餅分別移到含藥平板中央，每個處理設(shè)3次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

抑制率=×100%

根據(jù)生物統(tǒng)計機率值換算表，將抑制百分率換算成抑制機率值。用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，以處理濃度（mg/L）的對數(shù)值為橫坐標，相應(yīng)抑制機率值為縱坐標求出毒力回歸方程，并求出抑制中濃度EC50、EC95和相關(guān)系數(shù)（R）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀和形態(tài)學鑒定

病菌先侵害嫩葉，早期癥狀呈透明水漬狀小點，長約0.5 mm，隨后病斑沿主脈平行擴展成水漬狀黃色條斑。隨后黃色條斑中央出現(xiàn)紅色小點，整個病斑變?yōu)榧t褐色，周圍狹窄有黃色暈圈，成熟的病斑一般長2～25 mm，有的甚至長達50～75 mm，寬為2～4 mm（圖1-A）。發(fā)病嚴重時，條斑聯(lián)合成大斑塊，全葉變?yōu)榧t色；病斑輪廓不明顯，病葉提早干枯，植株青葉少，導(dǎo)致病株矮小。

從甘蔗病組織中共分離獲得5株菌株，編號為HT1～5。這些菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，灰綠色或淡褐色，邊緣菌絲呈灰白色，棉絮狀，邊緣菌絲較稀薄（圖2-A）。鏡檢觀察到分離物菌絲發(fā)達，分枝繁茂和分生孢子梗淡褐色（圖2-C，D），分生孢子呈橄欖綠色或淡褐色，近紡錘形或長橢圓形，微彎，具有3～11個隔膜，一般7～8個隔膜（圖2-B），與楊子林等[3]的報道一致。

2.2 病原菌致病性鑒定

用噴霧法將純化的菌株回接到健康甘蔗植株上，接種5 d后開始發(fā)病，癥狀與田間自然發(fā)病癥狀相同（圖1-B）。從發(fā)病植株上再分離得到的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，鏡檢后觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子，表明所分離到的病原菌是甘蔗褐條病的病原菌。

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析

用真菌通用引物ITS1/ITS4對致病性最強的菌株HT-4（KM494989）進行PCR擴增其rDNA-ITS序列（圖3），擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，目的片段長度為592 bp，將測序結(jié)果在NCBI上用BLAST軟件進行同源性比對，菌株HT-4與離蠕孢屬（Bipolaris）相似性達到99%。然后利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，所分離到的病原菌與Bipolaris setariae strain CBSHN01（GU290228.1）處于同一個分支，進化上的距離最近，根據(jù)上述病原菌的形態(tài)特征以及rDNA-ITS序列同源性比較的結(jié)果，表明菌株HT-4是甘蔗褐條病的病原菌。

2.4 不同藥劑對甘蔗褐條病病原菌的抑制作用

7種供試藥劑對甘蔗褐條病病原菌室內(nèi)毒力測定的結(jié)果（表1）表明，7種供試藥劑對甘蔗褐條病病原菌均有一定的抑制作用。其中，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡种谱饔眯Ч詈?，EC50值分別為4.400 6 mg/L和9.421 1 mg/L；其次是75%百菌清和70%代森錳鋅，EC50值分別為63.242 0 mg/L和37.068 1 mg/L；而65%代森鋅、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈抑制效果相對較差，EC50值分別為196.594 5、256.573 3、543.184 8 mg/L。在7種供試的殺菌劑中，50%咪鮮胺錳鹽的EC95值最小，為20.406 8 mg/L；其次是10%苯醚甲環(huán)唑其EC95值為49.155 6 mg/L。而70%代森錳鋅、75%百菌清、65%代森鋅、70%甲基硫菌靈、50%多菌靈EC95值均高于200 mg/L，分別為291.164 2、1 039.747 4、1 595.173 9、3 156.974 3、4 207.156 4 mg/L。說明不同的供試藥劑對甘蔗褐條病菌的毒力存在較大差異。根據(jù)毒力回歸方程斜率值可判斷病菌對藥劑濃度變化的敏感性，斜率值越大說明病原菌對藥劑的敏感性越強，即：在7種殺菌劑中，甘蔗褐條病菌對50%咪鮮胺錳鹽最敏感。

3 討論與結(jié)論

離孺孢屬是自然界中分布廣泛的一類真菌，可引起禾本科作物及雜草的嚴重病害，造成巨大的經(jīng)濟損失，也能引起作物發(fā)生根腐病[19-20]，如玉米小斑病[21]、稻胡麻葉斑病[22]、小麥根腐病[23]等。甘蔗褐條病菌人工接種可侵染一些禾本科雜草，在自然界中除甘蔗外，還沒有在其他植物上發(fā)現(xiàn)[5]。目前，關(guān)于甘蔗褐條病的研究，僅有楊子林等[3]、陳庭俊[8]、李秋陽等[12]對甘蔗褐條病的發(fā)生原因、特點及防治措施進行了報道，而關(guān)于甘蔗褐條病菌的分離、鑒定及其致病機理還未見報道。本研究從甘蔗病株上分離到5株菌株，通過致病性測定發(fā)現(xiàn)在分離到的5株菌株中，菌株HT-4的致病力最強，接種健康甘蔗葉片后發(fā)病速度快，并且接種植株的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，對回接葉片的病斑進行再分離，仍然分離到形態(tài)一致的菌株。結(jié)合形態(tài)學觀察和rDNA-ITS序列分析，確定菌株HT-4是引起甘蔗褐條病的病原菌。所分離到菌株與前人報道的甘蔗褐條病菌Bipolaris stenospila（AB179837.1）的rDNA-ITS序列存在一定的差異，推測不同菌株間可能存在遺傳多樣性。

由于分類系統(tǒng)的復(fù)雜性以及病原菌存在生理小種和多樣性，導(dǎo)致在病原菌的判定上存在一定的混淆，如甘蔗褐條病早期癥狀和孢子形狀大小均與甘蔗眼斑病相似，但兩者在成長斑上存在不同，甘蔗褐條病病斑沒有向葉尖產(chǎn)生與葉脈平行的壞死條紋[24-25]。

藥劑篩選試驗表明，7種藥劑對甘蔗褐條病菌都有一定抑制效果，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑?qū)υ摼囊种浦袧舛让黠@低于其它5種藥劑。目前農(nóng)業(yè)上多用多菌靈和甲基硫菌靈來防治該病害[5，12]，而本研究結(jié)果表明，50%咪鮮胺錳鹽和10%苯醚甲環(huán)唑明顯比多菌靈和甲基硫菌靈的毒力更強，推測可能是由于長期使用多菌靈和甲基硫菌靈導(dǎo)致甘蔗褐條病菌對其產(chǎn)生了抗藥性或不同地區(qū)甘蔗褐條病菌對藥劑的敏感性不同。因此，篩選防治甘蔗褐條病的有效藥劑，需進行藥劑的田間試驗來驗證，找出安全、經(jīng)濟有效的藥劑來減少藥劑用量、降低環(huán)境污染和防止病原菌產(chǎn)生抗藥性。

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