花生種子中芪化物的合成與抗黃曲霉菌產(chǎn)毒的相關(guān)性研究

王琴飛　王明　李莉萍　高玲　應(yīng)東山　張如蓮

摘 要 以花生種子為試材，采用孢子濃度為1×106（個(gè)/mL）的黃曲霉菌接種花生種子，對(duì)抗產(chǎn)毒和易產(chǎn)毒品種間4種主要芪化物（resveratrol， ε-viniferin， δ-viniferin， pterostilbene）合成變化，相關(guān)抗性酶活性（PAL、POD、PPO）進(jìn)行了比較，探討了不同品種間芪化物的合成與抗黃曲霉菌產(chǎn)毒之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：花生種子芪化物的合成速度與抗產(chǎn)毒有關(guān)。在接種黃曲霉菌第3天時(shí)，抗產(chǎn)毒品種黔花生3號(hào)4種芪化物含量達(dá)到峰值，含量為47.37 μg/g，為對(duì)照的54倍；易產(chǎn)毒品種花育22號(hào)芪化物含量?jī)H5.5 μg/g；抗產(chǎn)毒品種芪化物含量和相關(guān)抗性酶（PAL、POD、PPO）活性都高于易產(chǎn)毒品種；在16個(gè)考察的花生品種中，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)芪化物含量較高，病情指數(shù)和黃曲霉毒素含量相對(duì)較低的花生品種；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，不同花生品種芪化物含量與病情指數(shù)、黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素總量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r）分別為-0.789、-0.851、-0.850。因此，花生接種第3天時(shí)的芪化物含量可作為篩選和培育花生抗產(chǎn)毒品種的重要化學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 花生；芪化物；黃曲霉菌；抗性

中圖分類號(hào) R151.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）廣泛存在于多種植物如葡萄、虎杖、花生中，化學(xué)名為3，5，4′-三羥基-反-二苯乙烯（3，5，4′-trihydroxysitlbene），是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。1976年Ingham[1]首次在花生中分離得到了順、反式白藜蘆醇，在植物體中以穩(wěn)定的反式異構(gòu)體為主。以白藜蘆醇為基本單元氧化合成的聚合體稱為衍生物或芪化物[2-4]。研究證實(shí)，很多芪化物是Res在植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物[5]，目前在植物體內(nèi)檢測(cè)并穩(wěn)定存在的有云杉苷（Picied，PD），Res二聚體（ε-viniferin、δ-viniferin）和紫檀芪（Pterostilbene，PS）等[6]，具有與Res相似或更高的生物活性[7]，常作為植物的抗病指標(biāo)被深入研究[8-9]。

花生作為一種重要的“美味食品”和油料來(lái)源，受黃曲霉菌侵染后產(chǎn)生的黃曲霉毒素是公認(rèn)的強(qiáng)致癌物質(zhì)，已成為影響花生生產(chǎn)、加工和貿(mào)易的世界性問(wèn)題。而培育和篩選抗黃曲霉菌產(chǎn)毒和自身抗病的花生品種是解決此問(wèn)題最有效和最經(jīng)濟(jì)的途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在花生種子、花生油、花生愈傷組織中存在多種芪化物[10-11]。而花生種子切割或受病原菌感染后，可產(chǎn)生Res和trans-IPD有關(guān)的植保素，此類物質(zhì)是花生受到黃曲霉侵染后產(chǎn)生的主動(dòng)抗性因素（植物保衛(wèi)素）[12]。近年來(lái)，研究者在花生根端粘液組織和受黃曲霉菌、曲霉菌等真菌侵染的花生種子中，發(fā)現(xiàn)了多種白藜蘆醇異戊烯基類衍生物[13-14]，并且不同基因型的花生品種，Res異戊烯基類衍生物種類和含量都各不相同，受侵染后芪化物含量較低的花生品種也容易受番茄斑萎病毒和晚期葉斑病毒的侵染，而不同基因型的花生品種在沒(méi)有受到傷害時(shí)，芪化物含量無(wú)顯著的差異[15]。因此認(rèn)為這些芪化物可作為花生抗病和抗逆品種選育的潛在化學(xué)指標(biāo)。也有研究者證實(shí)，花生種子在受黃曲霉菌侵染后，Res的合成速率與品種的抗-感病性有關(guān)，抗產(chǎn)毒品種合成高峰早于易產(chǎn)毒品種[16]。另外，吸脹處理花生種子可提高花生品種（系）中白藜蘆醇含量，吸脹后的花生種子接種黃曲霉菌后，黃曲霉毒素含量與白藜蘆醇含量呈顯著負(fù)相關(guān)，并且在離體培養(yǎng)基中證明了Res對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒具有抑制作用[17]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在接種黃曲霉菌的花生種子中檢測(cè)到了6種芪化物，其中Res、PS和2種白藜蘆醇二聚體（ε-viniferin、δ-viniferin）在相同品種的花生種子中合成量受種植環(huán)境影響較大，與種植年度相關(guān)性較??；相同的種植條件下，不同品種4種芪化物的含量與侵染率呈負(fù)相關(guān)[18]，而同時(shí)以多種芪化物考察不同的花生品種的抗產(chǎn)毒能力還未見報(bào)道。在此研究基礎(chǔ)上，探索感-抗花生品種接種黃曲霉菌后4種主要芪化物（Res、PS、ε-viniferin、δ-viniferin）總量合成與相關(guān)抗性酶活性變化的差異；確定合適的接種時(shí)間，對(duì)不同品種中芪化物含量與病情指數(shù)、黃曲霉毒素含量之間相關(guān)性進(jìn)行分析，探討芪化物的合成與抗黃曲霉菌產(chǎn)毒之間的相關(guān)性，為培育和篩選高含量芪化物并抗產(chǎn)毒的花生品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的花生品種來(lái)源如表1所示，于2012年春季種植于農(nóng)業(yè)部植物新品種測(cè)試（儋州）分中心，種子采收后自然晾干，儲(chǔ)存于種子低溫低濕儲(chǔ)藏柜中（濕度：40%，溫度4～8 ℃）。黃曲霉菌（Aspergillus flavus，3.289 0）購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)。黃曲霉毒素B1、B2（Sigma公司，純度≥98%）；Res（Sigma公司，純度≥98%），PS（杭州廣林生物醫(yī)藥有限公司，純度≥99%），ε-viniferin由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院李景明教授饋贈(zèng)（純度≥95%）；δ-viniferin參照Pezet等[19]的研究方法制備（純度≥95%）。甲醇、乙腈（色譜純），美國(guó)Sigma公司；超純水。高效液相色譜儀（配備四元梯度泵LC2130，自動(dòng)進(jìn)樣器L2200，紫外檢測(cè)器LC2030，L-2485熒光檢測(cè)器，柱溫箱LC2061），日本Hitachi公司；芪化物的檢測(cè)采用色譜柱Purospher STAR RP-18e（Hiber 150 mm×4.6 mm，5 μm），購(gòu)買于德國(guó)Merck公司；黃曲霉毒素B1、B2的檢測(cè)采用色譜柱：Gemini C18（110A 250 mm×4.6 mm，5 μm），購(gòu)買于美國(guó)Phenomenex公司；Mycosep228凈化柱用于黃曲霉毒素的凈化（美國(guó)Romer Labs公司）；超純水采用Elix3+Synergy超純水系統(tǒng)制備（美國(guó)Millipore公司）；超聲波清洗器用于芪化物和黃曲霉毒素的提?。↘Q-400KDE，江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 花生種子黃曲霉菌的接種 選取飽滿、大小均勻無(wú)損的不同品種花生種子20粒，用70%的酒精表面消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌水開始浸泡到?jīng)_洗完畢的時(shí)間控制在13 min 以內(nèi)， 保證種子在復(fù)水之后含水量保持在20%左右[17]。在超凈工作臺(tái)中，將消毒后的花生種子置于滅菌的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿中加入1 mL孢子懸浮液1×106（個(gè)/mL），使每粒種子均勻粘上黃曲霉菌孢子，無(wú)菌水處理為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28 ℃下暗培養(yǎng)，分別于接種后0、1、3、5、7 d取出，同時(shí)記錄侵染率[20]。接種后的花生種子，液氮研磨成粉末后，-70 ℃冰箱保存待用。

同上方法接種16個(gè)不同花生品種（表1）的種子20粒，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。接種3 d后取出，統(tǒng)計(jì)受黃曲霉菌侵染達(dá)1/3粒數(shù)、2/3粒數(shù)和全部侵染粒數(shù)，計(jì)算不同品種的病情指數(shù)[20]。用70%酒精表面消毒種子3 min，在110 ℃烘箱中烘烤1 h。種子冷卻后研磨成粉末，-40 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)黃曲霉毒素。

1.2.2 芪化物的提取與檢測(cè) 參照王琴飛等[18]的研究方法提取和檢測(cè)芪化物，其色譜條件為：采用三元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B為水，C為2%甲酸水溶液。起始為5% A， 93% B，2% C（之后C相始終保持2%的比例），保持3 min；到30 min時(shí)A為60%，B為38%；37 min時(shí)A為85%，B為13%，保持3 min；到40 min時(shí)A為5%，B為93%。平衡柱子，進(jìn)下一個(gè)樣。流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm；進(jìn)樣體積為20 μL。采用外標(biāo)法定量，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3 PAL、POD、PPO活性測(cè)定 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）活性測(cè)定：準(zhǔn)確稱取0.5 g花生種子粉末于10 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液（內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇，pH8.8），搖勻，4 ℃下11 000 ×g離心15 min，上清液即為酶提取液。反應(yīng)體系包括：酶提取液0.5 mL、L-苯丙氨酸（0.02 mmol/L）1 mL、蒸餾水2.5 mL。混勻后37 ℃水浴1 h，加入0.2 mL HCl（6 mol/L）終止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)OD290值。以煮沸的酶液為對(duì)照，以⊿OD290值變化0.01為一個(gè)酶活性單位（U），結(jié)果以U/mg Pr/h計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法。

過(guò)氧化物酶（Peroxidase， POD）活性測(cè)定：采用愈創(chuàng)木酚顯色法，準(zhǔn)確稱取0.5 g花生種子粉末于10 mL離心管中，加入5 mL提取緩沖液（含1 mmol PEG、4%PVPP和1%Trion X-100），搖勻，4 ℃下11 000×g離心15 min，上清液即為酶提取液。反應(yīng)體系包括：0.1 mL酶提取液，3 mL 0.025 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液，0.4 mL 0.05 mol/L的醋酸緩沖液，最后再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。記錄1 min內(nèi)OD470變化值，結(jié)果以⊿OD470改變0.01為1個(gè)酶活性單位（U），結(jié)果以U/（mg Pr·min）計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO）活性測(cè)定：酶液提取同POD。反應(yīng)體系包括：酶液0.1 mL、0.05 mol/L鄰苯二酚溶液2.0 mL、0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）1.5 mL。于 30 ℃下反應(yīng)5 min，加入酶反應(yīng)計(jì)時(shí)，測(cè)定5 min之內(nèi)OD420值。以⊿OD420值變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U），結(jié)果以U/（g FW·min）計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 花生種子中黃曲霉毒素的提取及檢測(cè) 參照朱孟麗[21]方法稍作修改。稱取參試的不同品種花生種子粉末2.0 g于15 mL離心管中，加入10 mL 乙腈：水（84/16）溶液，混勻后，超聲提取30 min，8 000×g離心20 min，收集上清液為提取液。凈化：移取8 mL提取液至凈化柱的玻璃管中，緩慢推注，得到凈化液。衍生：取2 mL 凈化液至棕色具塞瓶中，在60 ℃水浴下以氮?dú)馊岷痛蹈桑尤?00 μL正已烷和100 μL 衍生液，混勻30 s后，在40 ℃干燥箱中衍生15 min，在室溫下蒸發(fā)后以水 ∶ 乙腈（85 ∶ 15）200 μL溶解，混勻30 s，8 000×g離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm的有機(jī)相膜，待上樣分析。

色譜條件：流動(dòng)相A為乙腈，B為水。起始為20% A，80% B，到8 min時(shí)A為30%，B為70%；10 min時(shí)A為40%，B為60%；到15 min時(shí)A為20%，B為80%。平衡柱子，進(jìn)下一個(gè)樣。流速：1.2 mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30 ℃。采樣外標(biāo)法定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPASS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件做相關(guān)性分析；采用Sigmaplot12.5畫圖軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生種子接種黃曲霉菌后4種芪化物和黃曲霉毒素的HPLC測(cè)定

以白藜蘆醇的最大吸收波長(zhǎng)306 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)Res、ε-viniferin、δ-viniferin、PS 4種芪化物進(jìn)行檢測(cè)，濃度為10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC色譜圖見圖1，樣品中的4種芪化物也得到較好的分離，保留時(shí)間分別為 18.182、21.568、23.257、30.832（圖1-A），與標(biāo)樣保留時(shí)間基本一致（圖1-B）。Res、ε-viniferin、δ-viniferin、PS在接種后的花生品種中都存在并相對(duì)含量較高，與黃曲霉菌抗病相關(guān)性較高[18]，因此實(shí)驗(yàn)僅對(duì)這4種芪化物進(jìn)行了檢測(cè)。以該方法對(duì)4種芪化物的不同濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)性較好，Res、ε-viniferin、δ-viniferin、PS 4種芪化物相關(guān)系數(shù)（R2）分別為：0.999 0、0.999 3、0.999 5、0.999 9。

當(dāng)黃曲霉毒素B1、B2的濃度分別為100 ng/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖2所示，樣品中黃曲霉毒素B1、B2的保留時(shí)間分別為4.293、7.327（圖2-A），保留時(shí)間與標(biāo)樣基本一致（圖2-B）。該黃曲霉菌菌種主要產(chǎn)生黃曲霉毒素 B1和 B2，所以樣品中僅檢測(cè)黃曲霉毒素B1和B2。以該方法對(duì)黃曲霉毒素B1、B2的不同濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)（R2）都為：0.999 0。

2.2 接種黃曲霉菌后侵染率、芪化物含量和抗性相關(guān)酶活性的變化

2.2.1 接種黃曲霉菌后侵染率的變化 對(duì)接種后抗侵染花生品種黔花生3號(hào)和易感品種花育22號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（表2），在考察的品種中，易感品種花育22號(hào)侵染率從0 d到第5天呈上升趨勢(shì)，第1天急劇升高達(dá)到60%，第3天達(dá)到90%。而抗侵染品種黔花生3號(hào)侵染率從0 d到第7天一直呈上升趨勢(shì)，第3天侵染率達(dá)27%，與花育22號(hào)相比，侵染速度較慢，整個(gè)接種時(shí)間內(nèi)侵染率低于易產(chǎn)毒品種。

2.2.2 接種黃曲霉菌后芪化物含量的變化 對(duì)接種黃曲霉菌前后2個(gè)花生品種中4種芪化物合成規(guī)律和相關(guān)抗性酶變化規(guī)律進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，花生在接種黃曲霉菌后，抗侵染品種黔花生3號(hào)在接種第3天芪化物總含量達(dá)到峰值，4種芪化物總量達(dá)到47.37 μg/g，為對(duì)照的54倍，而易感品種花育22號(hào)第3天才明顯增加，芪化物總量為5.49 μg/g，到第7天還處于上升的趨勢(shì)，即抗侵染品種接種黃曲霉菌后芪化物合成速度比易感品種快，抗侵染品種第3天達(dá)到峰值時(shí)，易感品種的芪化物含量低于抗侵染品種（圖3-A），變化趨勢(shì)與梁炫強(qiáng)等[16]研究結(jié)果相似。

2.2.3 接種黃曲霉菌后抗性相關(guān)酶活性的變化

PAL、POD和PPO是植物抗病代謝密切相關(guān)的3種酶，也是Res合成前體物質(zhì)和代謝的關(guān)鍵酶[22]。與對(duì)照相比，接種后抗-感品種PAL活性均有所升高，抗性品種的PAL活性在接種后第1天達(dá)到了峰值，為對(duì)照的3.1倍，隨后開始下降；而易產(chǎn)毒品種在接種3 d后開始上升，第7天時(shí)還處于上升趨勢(shì)，PAL活性抗侵染品種提高比易感品種快（圖3-B）。POD和PPO的活性變化在抗侵染品種間相似，接種后活性都有明顯提高，并在第5天時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的26.8和9.3倍，隨后呈下降趨勢(shì)，并且抗侵染品種中這2種抗性酶活性都高于易感品種。在易感品種中，POD活性在第7天還處于上升趨勢(shì)，而PPO在第5天時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始下降（圖3-C、D）?？傮w而言，在接種第3天時(shí)，抗侵染品種的3種酶活性都高于易感品種；除PPO外，抗侵染品種的PAL和POD活性高峰早于易感品種（圖3-B、C、D）。

2.3 花生品種接種黃曲霉菌后芪化物、病情指數(shù)、黃曲霉毒素的差異

芪化物的合成與抗黃曲霉菌產(chǎn)毒有一定的相關(guān)性，抗性品種較易感品種合成芪化物較快（圖3-A），在接種前3～5 d，白藜蘆醇含量也高于易感品種[16]，并且接種黃曲霉菌后3～5 d黃曲霉毒素含量處于上升期[23]。對(duì)16個(gè)花生品種的芪化物含量，病情指數(shù)和黃曲霉毒素B1、B2含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4種芪化物（Res、ε-viniferin、δ-viniferin和PS）總含量較高的花生品種為雜野3號(hào)、黔花生3號(hào)、628-35、貴陽(yáng)小花生，含量分別為54.4、43.5、40.4、35.9 μg/g（圖4-A）；同時(shí)，這幾個(gè)品種的病情指數(shù)和黃曲霉毒素B1的含量相對(duì)較低，分別為0.20、0.11、0.24、0.30和451、415、597、700 ng/g（圖4-B、C）。不同品種黃曲霉毒素B2與芪化物含量變化相關(guān)性不顯著（圖4-D）。從圖4可以看出，大部分花生品種芪化物含量越高，其病情指數(shù)和黃曲霉毒素B1 含量就越低。

2.4 花生品種間芪化物與病情指數(shù)、黃曲霉毒素的相關(guān)性

對(duì)不同品種芪化物含量與種子病情指數(shù)、黃曲霉毒素B1、B2及黃曲霉毒素含量之和（B1、B2）的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示（表3）：芪化物含量與病情指數(shù)、黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素之和呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r）分別為：、-0.789、-0.851、-0.850；芪化物含量與黃曲霉毒素B2之間為負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。不同品種的黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素之和相關(guān)性達(dá)到顯著，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999，證明種子接種黃曲霉菌后，黃曲霉毒素B1是接種后黃曲霉毒素的主要成分。不同品種表現(xiàn)的病情指數(shù)與黃曲霉毒素B1和2種黃曲霉毒素總含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為分別為0.783、0.766，表明病情指數(shù)可作為表觀的抗產(chǎn)毒指標(biāo)。不同的花生品種黃曲霉毒素B2的含量變化較為穩(wěn)定，為考慮總的抗產(chǎn)毒性，以黃曲霉毒素之和篩選抗產(chǎn)毒品種更為合理。

3 討論與結(jié)論

花生接種黃曲霉菌后啟動(dòng)了很多抗病因子可以抵抗黃曲霉菌的進(jìn)一步侵染。Res是植物次生代謝產(chǎn)物，通過(guò)苯丙氨酸代謝途徑合成，PAL是其合成前體物質(zhì)的關(guān)鍵酶和限速酶[24]，而Res合成的同時(shí)，也會(huì)在糖苷轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferase）、甲氧基轉(zhuǎn)移酶（Res-O-Methyltransferase），POD或PPO等作用下代謝成其他的芪化物[2，5，25]。因此，白藜蘆醇的代謝產(chǎn)物和相關(guān)代謝酶活性也是衡量抗病的重要因子。

對(duì)接種黃曲霉菌前后抗-感花生品種中4種芪化物合成規(guī)律和相關(guān)抗性酶活性變化規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，接種后抗產(chǎn)毒品種黔花生3號(hào)芪化物合成高峰（第3天）早于易產(chǎn)毒品種花育22號(hào)，即抗性品種受黃曲霉菌侵染后芪化物合成量提高比易感品種早（圖3-A）。在接種第5天時(shí)易產(chǎn)毒品種的芪化物含量才高于抗產(chǎn)毒品種。梁炫強(qiáng)等[16]研究表明，花生種子受病原菌侵染后，Res的合成速率與品種的抗-感病性有關(guān)，抗產(chǎn)毒品種合成白藜蘆醇的高峰也早于易產(chǎn)毒品種，雖然本研究接種的黃曲霉菌孢子濃度與之不同，但變化規(guī)律實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻相似。前期實(shí)驗(yàn)表明，在規(guī)定的接種時(shí)間內(nèi)（第3天）Res或相關(guān)的代謝產(chǎn)物與侵染率呈負(fù)相關(guān)，在考察的品種中Res、ε-viniferin、δ-viniferin和PS 4種芪化物總量占所檢測(cè)芪化物總含量的75.0%以上，芪化物含量之和與侵染率的相關(guān)系數(shù)（r）達(dá)到了-0.812。同時(shí)，同一品種在不同種植地區(qū)對(duì)黃曲霉菌的抗病性差異較大[18]。因此，為了減少環(huán)境等因素的影響，花生種子需要在同一地區(qū)種植后，以接種第3天時(shí)4種芪化物之和為考核指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)不同花生品種的抗產(chǎn)毒能力。

接種黃曲霉菌后，抗-感花生品種間PAL活性存在明顯差異。與對(duì)照相比，PAL酶活性都有明顯的提高；抗性品種PAL活性在接種1 d達(dá)到峰值，而易產(chǎn)毒品種則在接種3 d才明顯升高，第5天時(shí)才達(dá)到抗性品種的酶活性；并且PAL酶作為合成白藜蘆醇前體物質(zhì)的關(guān)鍵酶，抗性品種活性高峰都出現(xiàn)在芪化物合成高峰之前，說(shuō)明PAL活性高峰出現(xiàn)的早晚與花生種子接種黃曲霉菌后的抗性表現(xiàn)有一定關(guān)系。田立榮研究發(fā)現(xiàn)[23]，抗-感花生種子接種黃曲霉菌后出現(xiàn)不同的酶活性高峰，與對(duì)照相比都顯著提高，抗性材料明顯高于感病材料，抗產(chǎn)毒品種的活性高峰出現(xiàn)在接種第2天，造成與本研究不同結(jié)果的原因，可能是所采用的花生品種不同、病原菌株系不同從而導(dǎo)致寄主-病原菌之間相互作用不同。

POD和PPO屬于氧化酶系統(tǒng)，主要參與木質(zhì)素的聚合和酚類的氧化，從而形成抵御病原菌侵入的機(jī)械屏障[26]。研究表明[5，8，9]，在POD和PPO的作用下，白藜蘆醇可氧化合成白藜蘆醇二聚體（ε-viniferin，δ-viniferin），這2種二聚體可作為篩選葡萄抗病品種的化學(xué)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)表明，抗產(chǎn)毒品種的POD和PPO活性在接種7天內(nèi)前都高于易產(chǎn)毒品種。在第5天酶活性達(dá)到峰值時(shí)，芪化物總量顯著降低，可能是由于木質(zhì)素等酚類物質(zhì)的合成也消耗了部分酶（圖3-C、D），或許芪化物作為植物抗毒素，在受到逆境時(shí)本身會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低的變化規(guī)律[27-28]?；ㄉ臃N黃曲霉菌后，在芪化物含量或抗性酶活性未顯著增加之前，易產(chǎn)毒品種的侵染率就達(dá)到了60%，而抗產(chǎn)毒品種的侵染率一直較低（表2），研究者認(rèn)為，接種后抗產(chǎn)毒材料表達(dá)的速度快、強(qiáng)度高，酶活性顯著上升，可迅速合成足夠量的次生代謝物質(zhì)，起到抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)或產(chǎn)毒的作用，并推測(cè)抗產(chǎn)毒品種在受到黃曲霉菌侵染后種子本身充分啟動(dòng)了苯丙烷代謝途徑；而易產(chǎn)毒品種各種防御酶受誘導(dǎo)發(fā)揮作用的速度和強(qiáng)度不如抗產(chǎn)毒品種，因此不能及時(shí)產(chǎn)生足夠量的抗性物質(zhì)，從而不能及時(shí)或不足以抵抗真菌的侵染和產(chǎn)毒[23]。芪化物是抗癌和抗氧化等多方面的有益因子，進(jìn)一步探索花生中芪化物的合成及代謝規(guī)律，對(duì)于合理調(diào)控和提高花生中芪化物的含量，增強(qiáng)花生的抗產(chǎn)毒能力具有重要的作用。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)芪化物含量高、病情指數(shù)低、黃曲霉毒素含量也相對(duì)較低的花生品種，然而進(jìn)行花生抗黃曲霉菌產(chǎn)毒的品種資源篩選時(shí)，其他的品質(zhì)性狀也很重要。有研究者對(duì)種子大小，出仁率，蛋白含量，含油量，油酸等與抗黃曲霉菌產(chǎn)毒進(jìn)行了相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)高含油量、高蛋白質(zhì)含量和高油酸資源對(duì)黃曲霉菌侵染和產(chǎn)毒的抗性較差；相關(guān)分析表明，不同花生品種種子大小、油酸含量和含油量與抗黃曲霉菌產(chǎn)毒呈顯著負(fù)相關(guān)[20，29]。因此，要得到芪化物含量較高、其他品質(zhì)性狀較好的花生品種，有待筆者進(jìn)一步研究探索。

花生種子接種黃曲霉菌后，抗-感品種的芪化物合成速度有明顯差異，抗產(chǎn)毒芪化物含量高峰早于易產(chǎn)毒品種；在接種黃曲霉菌第3天，抗產(chǎn)毒品種芪化物含量和相關(guān)抗性酶（PAL、POD、PPO）活性都高于易產(chǎn)毒品種；不同花生品種接種黃曲霉菌3天時(shí)，芪化物含量與病情指數(shù)、黃曲霉毒素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；病情指數(shù)可作為篩選抗侵染和抗產(chǎn)毒品種的表觀指標(biāo)。因此，芪化物含量可作為篩選花生種質(zhì)抗黃曲霉菌產(chǎn)毒的重要參數(shù)，但要得到芪化物含量較高、其他品質(zhì)性狀較好的花生品種還有待進(jìn)一步研究探索。

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