黑尾近紅鲌3種同工酶的組織特異性研究

陳見等

摘要[目的]了解黑尾近紅鲌的遺傳特性。[方法]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，對黑尾近紅鲌肝、腎、心、腦、肌和眼6種組織中乳酸脫氫酶（LDH）、酯酶（EST）及蘋果酸脫氫酶（MDH）進行電泳分析。[結果]LDHB4在心臟和腦中優(yōu)勢表達，LDHA4在肌肉中優(yōu)勢表達，而LDHC只在肝臟中檢測到；EST在腎、心、肝中活性較強，其中腦和肝組織有6條帶，腎組織有5條帶；mMDH在心臟中表現(xiàn)為典型的二聚體2條酶帶，sMDH在所分析的6種組織都有分布。[結論]黑尾近紅鲌6種組織中3種同工酶酶帶的組成及活性均有所不同，表現(xiàn)出較明顯的組織特異性。

關鍵詞黑尾近紅鲌；同工酶；組織特異性

中圖分類號S965.199文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）29-049-03

黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）又名高尖、黑尾鲌、黑尾、大白刁等，隸屬鯉形目、鯉科、鲌亞科、近紅鲌屬，屬于肉食性偏雜食性魚類，是長江上游特有經(jīng)濟魚類，其營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，深受養(yǎng)殖戶喜愛。該品種具有養(yǎng)殖成本低、生長速度快、耐低氧能力強、易捕撈、易活魚上市、食性雜、抗病力強等優(yōu)勢，是淡水養(yǎng)殖領域中新的優(yōu)良、高效養(yǎng)殖對象之一。

同工酶是指具有相同的催化活性且在電場中的運動存在多種可分離形式的酶。同工酶在魚類各組織中具有顯著特異性，已廣泛地用于魚類分類鑒定、個體發(fā)育、雜種與種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性及進化分析、遺傳育種等方面[6-7]。

筆者采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對黑尾近紅鲌的乳酸脫氫酶（LDH）、酯酶（EST）及蘋果酸脫氫酶（MDH）等生化遺傳特性進行研究，以期為黑尾近紅鲌的種質(zhì)鑒定及選擇育種提供一定的基礎數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用黑尾近紅鲌來自國家級“湖北武漢鲌魚良種場”。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器。北京六一DYY-6C型電泳儀電源、北京六一DYCZ-24A型雙垂直電泳槽、北京六一WD-9405B型脫色搖床、上海恒平JY6002型電子天平、德國Eppondorf公司5810R型臺式高速冷凍離心機玻璃制勻漿器。

1.2.2試劑。丙烯酰胺、N，N′—甲叉雙丙烯酰胺、TEMED催化劑、過硫酸銨、溴酚藍、緩沖液和染色液相關試劑。

1.3方法

1.3.1樣品液的制備。

對黑尾近紅鲌采用斷鰓放血方法致死，在冰浴條件下取出其肝、腎、心、腦、肌和眼6種組織并洗凈。在冰上進行組織勻漿，勻漿緩沖液為pH 7.0、濃度 0.1 mol/L磷酸緩沖液，將已勻好的勻漿液在4 ℃條件下靜置1 h后，15 000 r/min、4 ℃下離心20 min后取上清液，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳。

采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，凝膠制備參照《現(xiàn)代分子生物學實驗技術》，電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸溶液，在4 ℃條件下進行預電泳30 min。

經(jīng)預電泳后，以5∶1的比例混合的酶液和溴酚藍指示劑，用微量取液器取50 μl混合好的酶液加入點樣孔。在4 ℃條件下正式電泳，當樣品在濃縮膠遷移時電壓控制為50 V，等到樣品進入分離膠后電壓升至200 V，直至溴酚藍指示劑距分離膠底部1 cm時停止電泳。

1.3.3染色和固定。

乳酸脫氫酶、酯酶和蘋果酸脫氫酶3種酶的染色方法分別參照張慶朝、趙贛等[10-11]。將凝膠于37 ℃染色液中避光染色，顯色完成后，將凝膠板用去離子水漂洗2～3次，在7%的冰醋酸溶液中固定，對染色和固定好的凝膠板用相機進行拍照并進行分析。

2結果與分析

2.1乳酸脫氫酶（LDH）

目前，已知編碼魚類的LDH同工酶基因座包含3個位點，存在多種形式，其中LDH-C位點編碼單獨編碼C蛋白且靠近陰極[12]。從圖1可以看出，黑尾近鲌LDH同工酶活性具有組織特異性，在腎、心、腦、肌、眼組織中均可見5條酶帶，其中LDH-B4在心臟和腦中優(yōu)勢表達，LDH-A4在肌肉中優(yōu)勢表達，而LDH-C只在肝臟中檢測到，這種特異性與不同組織的相應生理功能密切相關。

2.2酯酶（EST）

魚類酯酶比較復雜，以單體酶或多聚體酶等形式存在，且其編碼基因位點較多，呈現(xiàn)出普遍的多態(tài)性。從圖2可以看出，EST在黑尾近紅鲌的6種組織中均有分布，在腎、心和肝中活性較強，其中腦和肝組織有6條帶，腎組織有5條帶，這3種組織中的酯酶分布形式最多。

2.3蘋果酸脫氫酶（MDH）

MDH同工酶在魚類以二聚體形式存在，包括細胞質(zhì)型（s-MDH）和線粒體型（m-MDH）2種類型，且均由2個基因位點編碼[14]。從圖3可以看出，黑尾近紅鲌的m-MDH在心臟中表現(xiàn)為典型的二聚體2條酶帶，在腦和肌中亦有分布。s-MDH在6種組織都有分布，其中肝、腎、心和腦均為2條酶帶，而其他組織為1條酶帶，尤其在肝、腎及腦中表達活性最強。

3討論

該試驗結果表明黑尾近紅鲌的6種組織中3種同工酶在組成和活性上表現(xiàn)出明顯的組織特異性，這與相應組織器官的生理功能密切相關[15]。黑尾近紅鲌同工酶組織特異性主要表現(xiàn)在以下方面：①同工酶表達的位點多態(tài)性，某些位點的同工酶僅在特定組織表達；②同工酶表達強弱不同，主要表現(xiàn)在同一位點不同組織的表達強弱不一樣；③同工酶表達的等位基因不同，同一位點的在不同組織中會有不同的同工酶。

LDH是糖酵解過程中的重要酶，可將無氧下產(chǎn)生的丙酮酸還原為乳酸并產(chǎn)能供機體所需。魚類的LDH同工酶研究比較深入，已證明LDH是四聚體，編碼魚類的LDH同工酶基因座包含3個位點，分別為LDHA、LDHB、LDHC，通常情況下四聚體LDH由A、B 2個亞基組合成5種同工酶，分別為B4、AB3、A2B2、A3B、A4，B亞基遷移速率大于A亞基，C位點編碼的蛋白質(zhì)電荷與A、B不同且靠近陰極。LDHB4主要位于好氧性器官組織（如心臟）中，LDHA4主要位于厭氧性器官組織肌肉中。該研究中的黑尾近紅鲌肌肉組織中的LDHA4表達要強于其他組織，這與晁珊珊等[16]對齊口裂腹魚研究結果及馬波等[17]對興凱湖翹嘴紅鲌研究結果類似。C位點編碼的蛋白在魚眼中首先被發(fā)現(xiàn)，隨后在一些魚類肝臟中也發(fā)現(xiàn)C位點的表達。該研究中LDH-C僅在黑尾近紅鲌肝臟中特異性表達，可能與其肝臟代謝旺盛密切相關。在對翹嘴鲌、蒙古紅鲌、青梢紅鮊及海南紅鲌[17-19]的研究中也發(fā)現(xiàn)肝臟具有C酶帶。

EST是一種水解類酶，可催化酯類化合物的水解，參與能量代謝，還可代謝大量非正常存在的酯類，起到解毒功能。一般認為，在硬骨魚類中EST是以單體或二聚體形式存在，由多個位點編碼，存在多態(tài)現(xiàn)象。魚類肝和腎等組織不僅作為主要的能量代謝組織，也是重要解毒組織。該研究中黑尾近紅鲌腎臟、肝臟及心臟中EST的含量比較豐富，這與其提供能量并降解代謝廢物、毒素等復雜的生理功能相適應，在淡水黑鯛、白甲魚[14]、巖原鯉 、刺鯉研究中有著相似的結果。

MDH是生物氧化重要酶類，其負責使蘋果酸脫氫為草酰乙酸參與糖酵解后的有氧代謝[13，22]；因此MDH在一些有氧代謝旺盛的組織（如肝、腎等）中含量豐富、染色深。黑尾近紅鲌中的MDH存在細胞質(zhì)型（sMDH）和線粒體型（mMDH）2種，在對褐點石斑魚[22]和松江鱸魚研究中也發(fā)現(xiàn)存在2種類型的MDH。這2種MDH都是在黑尾近紅鲌肝臟和心臟中染色較深，這與其有氧代謝旺盛有著密切關聯(lián)性。

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