椰子平臍蠕孢葉斑病病原菌鑒定及生物學特性測定

摘 要 2012年10月，在海南省文昌市的椰子苗圃中，發(fā)現(xiàn)了一種新的葉斑病。顯微觀察表明，病原菌分生孢子稍彎曲，淺褐色，紡錘狀或梭狀，具有5～9個假隔膜、分生孢子梗多單生，直立或稍彎曲，表明其為平臍蠕孢屬（Bipolari. sp）。ITS序列分析表明其和4株狗尾草平臍蠕孢的序列同源性（HE792936.1，JX462256，GUO73108.1，F(xiàn)J606786.1）的同源性為99%。生物學特性研究結(jié)果表明：該菌菌絲適宜生長溫度為20～30 ℃，菌絲生長和孢子最適萌發(fā)溫度分別是25 ℃和30 ℃；最適pH值為4～11；玉米粉培養(yǎng)基（CAM）及馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）最適合菌絲生長，最佳碳源為蔗糖，甘油不適合菌絲生長；最佳氮源為蛋白胨，其次是磷酸氫二銨；完全光照有利于菌絲生長。菌絲及分生孢子的致死溫度和時間分別是56 ℃，15 min。

關(guān)鍵詞 椰子；平臍蠕孢；生物學特性

中圖分類號 S435. 61 文獻標識碼 A

Abstract In October 2012， a new leaf spot disease was observed on coconut seedlings in Wenchang， Hainan province. Based on microscopic observation， the conidiophores were slightly flexuous or straight， produced curved， spindle-shaped or fusiform， septate conidia with 5 to 9 pseuedo-septa. Thus， the pathogen belong to Bipolari. sp. Furthermore， the result of ITS sequence analysis revealed 99% sequence similarity with B. setariae. The results of biological characteristics showed that CAM and PDA medium were the best for the mycelial growth of pathogen. Temperature ranged from 20 to 30 ℃ were optimum for its mycelia growth， and conidia germinated best on 30 ℃. pH ranged from 4 to 11 was optimum for its mycelia growth. The mycelia grew best on media with sucrose as C source. Peptone nitrate and was the best nitrogen sources for mycelial growth and the（NH4）2HPO4 nitrate was the second. Continuous light was the best for mycelial growth. The lethal temperature was 56 ℃， 15 minutes for hypha growth and conidiospore.

Key words Cocos nucifera L.； Bipolaris.sp； Biological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.023

椰子（Cocos nucifera L.）屬于棕櫚科椰子屬，是熱帶地區(qū)主要的木本油料作物之一，綜合利用經(jīng)濟效益高，故享有“寶樹”之稱， 具有極其重要的觀賞價值[1]。在海南、廣西、廣東、云南、四川、福建及臺灣等省（區(qū)）均有種植，其中主要集中在海南省，種植面積已達到約14萬hm2[2]。隨著海南國際旅游島建設(shè)步伐的加快，椰子的需求量日益增加、供不應(yīng)求，其經(jīng)濟價值也逐年提升，致使椰子種植面積不斷擴大，但隨之而來的椰子樹的病害也日趨嚴重，制約了椰子產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

2012年10月，筆者在海南省文昌市椰子研究所椰子種植苗圃發(fā)現(xiàn)了一種新的葉斑病，該病主要為害椰子葉，嚴重影響長勢并降低觀賞價值。該病主要危害2～6齡椰子幼苗，嚴重時病斑擴大至葉尖，整片葉子枯萎死亡。本實驗開展該病害的病原菌鑒定和生物學特性研究，為進一步開展該病害的防治工作提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 椰子品種和平臍蠕孢葉斑病病樣 病樣來源：椰子平臍蠕孢葉斑病病樣采自海南省文昌市椰子研究所；接種材料：椰子大觀園椰子葉，椰子品種為海南本地高種。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），椰葉瓊脂培養(yǎng)基（CLAM），椰子肉培養(yǎng)基（CMAM），查氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek），理查德瓊脂培養(yǎng)基（Richard），燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OMAM）玉米培瓊脂培養(yǎng)基（CAM），詳細配方見參考牛曉慶等[3]文獻。

1.1.3 供試試劑 Taq酶、dNTPs、膠回收試劑盒（Gel Extraction Mini Kit W5221）等購自天跟生化科技（北京）有限公司，引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGA

ACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATA

TGC-3′）由上海生工生物工程股份有限公司（上海生工）合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與致病性測定 按常規(guī)分離方法分離和純化病原菌[4]。取在玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的病原菌，加10～15 mL無菌水，用無菌刀片刮取菌絲，2層濾紙過濾菌絲，將孢子濃度調(diào)為105（個/mL）。洗凈的椰子葉片以葉脈為界，兩邊均用滅菌針頭刺6～7個傷口，取100 uL孢子液涂抹一邊，另一邊涂等量無菌水為對照，3次重復。葉片放置于25 ℃培養(yǎng)箱。逐日觀察發(fā)病情況。根據(jù)再分離菌株菌落特征以及分生孢子形狀，與最初分離的菌株進行比較以確認分離物的致病性。

1.2.2 病原菌鑒定 （1）病原菌形態(tài)觀察。打取生長7 d、大小6 mm×6 mm的病原菌菌絲塊，置于鋪有潤濕濾紙的干凈培養(yǎng)皿上，于25 ℃保濕培養(yǎng)，7 d后觀察分生孢子梗的形態(tài)；病原菌在玉米培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，觀察孢子形態(tài)并測量其大小，所用設(shè)備為倒置生物顯微鏡（Leica DMIL）及其配備的系統(tǒng)軟件Leica Application Suite 3.80。

（2）ITS序列分析。采用尿素法提取菌絲基因組DNA[5]。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。PCR反應(yīng)混合液總體積為 25 μL：包括2 μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，2.5 mmol/L的dNTPs 1.0 μL，引物各0.5 μL，5 U/μL的Taq酶0.5 μL，模板2.0 μL，雙蒸水補足到25 μL，混勻。PCR反應(yīng)程序按參考牛曉慶等[3]文獻進行。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行回收，回收產(chǎn)物送往上海生工用引物為ITS1和ITS4進行測序，然后將所獲序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上進行比較分析。

1.2.3 病原菌生物學特性研究 將病原菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d，打取直徑為6 mm的菌餅，接種于培養(yǎng)基平板（Φ=9 cm）中央進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基設(shè)PDA、CLAM、CMAM、Richard、CAM、OMAM、Czape等7個處理；溫度設(shè)5、10、15、20、25、30、35 ℃等7個處理，pH值設(shè)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11等10個處理，光照設(shè)完全黑暗、完全光照和光暗交替（光照和黑暗各12 h）3個處理。碳氮源分別設(shè)葡萄糖、阿拉伯樹膠粉、乳糖、甘露醇、甘油、果糖和蛋白胨、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、磷酸二氫銨等處理（參照Czapek培養(yǎng)基的配方，用等量的碳源或氮源置換其中的蔗糖或硝酸鈉），以不加碳源或氮氮為對照。各處理均重復6次，培養(yǎng)7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，所得數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進行處理[6]。

參照（1）的方法制備菌塊，放入裝有無菌水的試管內(nèi)，分別于40、45 、50、55、56、57 ℃處理15 min。將處理后的菌塊接種PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)4 d后觀察生長情況。

制備病菌濃度為105（個/mL）的孢子液。取1～2滴滴加于干凈凹載玻片上，分別在5、10、15、20、25、30、35 ℃培養(yǎng)6 h，取出鏡檢孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過分生孢子直徑的一半視為萌發(fā)[4]。每個處理不少于10個視野，100個孢子，計算孢子萌發(fā)率，用DPS軟件進行分析。取0.5 mL孢子液，分別于40、45、50、52、55、56、57 ℃處理15 min，后涂布在PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)4 d后觀察萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定

從椰子葉病斑病健交界處分離純化得到一菌株，將菌株編號為YC-19。該病原菌主要侵染幼齡椰子，發(fā)病初期，在椰子葉片上產(chǎn)生褐色水漬狀病斑，病斑形狀橢圓至圓形或不規(guī)則形，周圍有淺黃色暈圈（圖1）。嚴重時病斑褐色面積擴大，有黑褐色暈圈出現(xiàn)，最外圍仍是淺黃色暈圈，病部向葉尖擴展，導致葉尖枯萎至灰褐色最終導致整個葉片灰色死亡（圖2）。接種菌絲塊10 d后，接種位點出現(xiàn)和田間類似的癥狀（圖3）。接種所用的孢子濃度為3.1×105個/mL。從接種后發(fā)病病斑上重新分離獲得了病原物，其培養(yǎng)性狀和分生孢子形態(tài)與最初分離物一致，表明這菌株YC-19為該病的致病菌。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌形態(tài)學鑒定 病原菌YC-19在CMA培養(yǎng)基上，菌落初期是灰白色，菌絲輪紋狀擴展，隨著培養(yǎng)時間增加，菌落變?yōu)榛液谏▓D4）。顯微觀察表明分生孢子表面光滑，褐色，稍彎曲或長梭形彎曲，兩端鈍圓（圖5），臍點位于基細胞內(nèi)，平截（圖6），略突出，有5～9個假隔膜，分生孢子大小為39～86 μm×9～16 μm。分生孢子梗單生，直立或稍彎曲，寬5～11 μm（圖7），根據(jù)以上描述特征，并參考Dimuthu[7]文獻將椰子葉枯病的病原鑒定為平臍蠕孢真菌（Bipolaris sp.）。

2.2.2 分子鑒定 電泳結(jié)果表明擴增片段大小約為0.5 kb，測序結(jié)果表明所獲序列為532 nt。序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KJ605157。分析表明該序列與4株狗尾草平臍蠕孢菌Bipolaris setariae的ITS序列（HE792936.1，JX462256，GUO73108.1，F(xiàn)J606786.1）具有99%的同源性。

2.3 病原菌生物學特性研究

2.3.1 培養(yǎng)基對菌落生長的影響 培養(yǎng)結(jié)果表明，YC-19在供試的8種培養(yǎng)基上均能生長，在CAM和PDA平板上生長最快，7 d后菌落直徑分別為（74.1±1.24）和（69.6±1.32）mm（圖8）。

2.3.2 溫度對菌落生長的影響 從圖9可以看出，適合病原菌YC-19生長的溫度范圍是20～30 ℃，在25 ℃時生長速度最快，菌落直徑為（87.1±0.48）mm，與其他溫度下的菌落直徑有顯著差異；低于10 ℃或高于40 ℃都不能生長。表明YC-19菌絲生長的最適溫度為25 ℃；在5～30 ℃內(nèi)，孢子萌發(fā)率呈遞增趨勢，30 ℃時達到最高，為84%，30 ℃以后，孢子萌發(fā)率下降，40 ℃時，僅為8%。

2.3.3 pH值對菌落生長的影響 在pH為4～11的PDA培養(yǎng)基平板上，病原菌YC-19均能正常生長，且菌絲生長良好，10 d后幾乎長滿整個平板（圖10）。

2.3.4 碳源對菌絲生長的影響 碳源對YC-19菌落生長有較明顯影響。在果糖、乳糖、葡萄糖、阿拉伯樹膠粉、甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上，菌落直徑均大于缺碳對照，只有甘油為碳源時菌落直徑小于對照。蔗糖為碳源時，菌落直徑為（73.6±2.46）mm，最適合YC-19的生長；其次為葡萄糖，阿拉伯樹膠粉和果糖，菌落直徑分別為（47.5±1.51）mm，（45.7±1.03）mm和（43.6±1.24）mm菌絲生長較旺盛；甘油作為碳源時菌落直徑最小，分別為（28.7±1.83）mm，且菌絲長勢不好（圖11）。

2.3.5 氮源對菌落生長的影響 氮源對YC-19的菌絲生長沒有明顯影響。蛋白胨作為氮源時，YC-19的菌落直徑達（62.3±2.44）mm；其次為磷酸氫二銨，菌落直徑為（61.0±1.97）mm，且菌絲生長茂盛；硝酸鉀作為氮源時，菌落直徑僅為（35.2±0.54）mm， 表明供試氮源中蛋白胨是YC-19菌絲生長的最適氮源，其次為磷酸氫二銨（圖12）。

2.3.6 光照對菌落生長的影響 光照條件對YC-19菌落生長影響較大，表明菌絲生長光照要求比較嚴格。光照和光暗交替及完全黑暗條件下的菌落直徑差異顯著，其中黑暗條件下的菌落直徑僅（22.8±2.31）mm，而光照條件下，菌落直徑高達（57.5±2.73）mm。光暗交替條件下的菌落直徑介于二者之間（圖13）。

2.3.7 菌絲和分生孢子致死溫度測定 對不同溫度處理過的菌塊培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)過57 ℃處理15 min后，菌絲塊失去生長能力，分生孢子經(jīng)56 ℃以上溫度處理15 min后，孢子即完全喪失了萌發(fā)能力，致死溫度和時間分別為56 ℃，15 min（圖14）。

3 討論與結(jié)論

本文對新發(fā)現(xiàn)的一種椰子葉部病害病原YC-19進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，最終將其歸為狗尾草平臍蠕孢菌（Bipolaris setariae），并對其生物學特性進行了初步研究。結(jié)果表明，最適合菌絲生長的培養(yǎng)基是CMA培養(yǎng)基；該病原菌菌絲生長適宜溫度為20～30 ℃，最適溫度是25 ℃，10 ℃以下，40 ℃以上停止生長；在CMA培養(yǎng)基上分生孢子的最適萌發(fā)溫度是30 ℃，其次為25 ℃；菌絲和分生孢子的致死溫度和時間為56 ℃，15 min；該病菌的適宜pH值為4～11，范圍較廣，酸或堿的條件下幾乎不影響菌絲的生長。最適合菌絲生長的碳源和氮源分別是蔗糖和蛋白胨，除了甘油會抑制菌絲生長外，對碳氮源的要求也不嚴格，說明該菌具有很強的環(huán)境適應(yīng)性。

該病原菌主要侵染幼齡椰子，發(fā)病初期，在椰子葉片上產(chǎn)生褐色病斑，病斑形狀橢圓至圓形或不規(guī)則形，周圍有淺黃色暈圈，嚴重時病斑褐色面積擴大，有黑褐色暈圈出現(xiàn)，最外圍仍是淺黃色暈圈，與椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis palmarum）引起的癥狀不同?；野卟“l(fā)病初期葉片出現(xiàn)橙黃色圓點，后擴展成灰色條斑，病斑中心有黑色小顆粒[8]，而該病菌引起的病斑中心無明顯病征；該病菌引起的病癥與Bipolaris incurvata引起的椰子枯萎病菌相似，但Bipolaris incurvata分生孢子為8～13個假隔膜，大小為100～150×19～22 μm，與B. setariae分生孢子5～9個假隔膜，大小為39～86 μm×9～16 μm不同[9]。依據(jù)以上所述該新病害的發(fā)病特點及對病原的鑒定結(jié)果，根據(jù)病原菌屬名而將該病害命為平臍蠕孢葉斑病。狗尾草平臍蠕孢菌寄主范圍比較廣，其寄主除本文所報道的椰子外，還有禾本科雜草，如牛筋草（Eleusine indica L.） Gaertn，馬唐（Digitaria sanguinalis L.）Scop，小麥（Triticum aestivum L.），谷子（Setaria italica L.），玉米（Zea mays L.）等[10]。該菌其是否侵染其他熱帶油料作物的葉片或果實是后續(xù)的研究內(nèi)容之一，且本文尚未對YC-19的產(chǎn)孢特性進行詳盡研究，僅對分生孢子致死溫度和溫度對孢子萌發(fā)的影響進行了研究，對適合菌絲生長的培養(yǎng)基進行篩選的同時，初步檢測了產(chǎn)孢量，發(fā)現(xiàn)CMA最適合狗尾草平臍蠕孢菌的產(chǎn)孢，培養(yǎng)15 d后，有大量孢子產(chǎn)生，其他培養(yǎng)基都不易產(chǎn)生孢子或不產(chǎn)生孢子。至于溫度，pH值，光照及碳氮源對狗尾草平臍蠕孢菌產(chǎn)孢的影響，需要進一步研究。

參考文獻

[1] 符家豪， 顏春梅. 海南椰子[J]. 特種經(jīng)濟動植物， 2000（3）： 40.

[2] 王永壯， 覃偉權(quán). 海南椰子主要病蟲害及其防治[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學， 2005， 87（5）： 59-62.

[3] 牛曉慶， 陳良秋， 付登強， 等. 油茶葉枯病菌的鑒定及生物學特性研究[J]. 熱帶作物學報， 2013， 3（2）： 1-7.

[4] 方中達. 植病研究法第三版[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1998.

[5] 曹文波， 鄭璐璐， 謝文海. 一種提取植物基因組DNA的方法-改良尿素法[J]. 華中師范大學學報， 2008， 42（3）： 448-451.

[6] 唐啟義， 馮明光. 實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M]. 北京： 科學出版社， 2002.

[7] Dimuthu S M， Lei Cai， Eric H C， et al. A phylogenetic and taxonomic re-evaluation of the Bipolaris-Cochliobolus-Curvularia Complex[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 131-144.

[8] Bhaskaran R， Karthikeyan A R. Leaf blight disease of coconut palm[J]. Indian Coconut Journal， 2007， 10（2）： 2-5.

[9] Kamalakannan A， ValluvaparidasanV， Rabindran R， et al. First report of Bipolaris leaf blight of coconut（Cocos nucifera）caused by Bipolaris incurvata in mainland India[J]. Plant pathology， 2006， 55（4）： 579.

[10] 趙杏利， 鄧 暉， 牛永春. 一種狗尾草病原真菌的鑒定及菌株致病性研究[J]. 菌物學報， 2010， 29（2）： 172-177.