雛雞沙門氏菌病的生化鑒定與綜合防治

李亞妮 李培峰

摘 ?要：采集平定縣某自然發(fā)病雞場15只病死雛雞病料，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、病理組織學(xué)觀察、生化試驗、平板凝集試驗，確診為雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌兩種血清型混合感染所致。利用紙片法藥敏試驗，結(jié)果顯示6株沙門氏菌的高敏藥物有6種，分別是頭孢呋肟、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素。使用頭孢呋肟對群體進(jìn)行治療，雞群病情明顯改善。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;生化鑒定; 藥敏試驗;綜合防治

中圖分類號：S858.314.4+3 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2015）03-0009-05

雞沙門氏菌是由沙門氏菌屬中一個或多個成員所引起的雞急性或慢性傳染病[1]，引起禽類發(fā)病的沙門氏菌主要有雞白痢沙菌、雞傷寒沙門氏菌及有鞭毛能運動的多種副傷寒沙門氏菌[2]，一直是危害養(yǎng)雞生產(chǎn)的最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，沙門氏菌具有致病性強、垂直傳播等特點，而且由于抗菌藥物的濫用，沙門氏菌的耐藥譜也越來越廣，一旦感染，防治困難較大，可給種雞及蛋雞生產(chǎn)帶來極大損失[2，3]。目前我國一些規(guī)模較大的種禽場對雞白痢已經(jīng)實施了比較嚴(yán)格的凈化措施，但仍有相當(dāng)一部分雞飼養(yǎng)者為小規(guī)模養(yǎng)殖，缺乏雞白痢的凈化意識，舍不得投入，該病的危害仍然比較嚴(yán)重。陳自望等1999、2003、2004年對福州市部分父母代種雞場進(jìn)行了雞白痢桿菌病的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3年的平均陽性率分別為18.8%、30.7%、70.9%，陽性率逐年呈上升趨勢，且陽性率很高[4]。

雞沙門氏菌病的發(fā)生與傳播的主要階段是在育雛的早期。因此，必須重視育雛期的環(huán)境控制，進(jìn)行合理消毒，防止水平傳播的發(fā)生。吳斌等[5]從進(jìn)口的213份樣品中，共發(fā)現(xiàn)了13株沙門氏菌，其中魚粉中占4.69%（3/64），肉骨粉中占9.43%（10/106）?？梢?，飼料中的沙門氏菌也直接威脅著飼用雞只的健康。

為了減輕由此造成的死亡和損失，許多雞場都積極地用藥物進(jìn)行本病的防治。焦新安等對我國部分地區(qū)1962～1999年間346株雞白痢沙門氏菌進(jìn)行了藥物敏感性測定，結(jié)果表明，在近40年時間里，雞白痢沙門氏菌對氨芐青霉素、壯觀霉素、復(fù)方磺胺、磺胺異惡性唑、甲氧芐胺嘧啶、羧芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素、青霉素的耐藥率顯著增強，菌株的多重耐藥率明顯增加[6]。為提高療效，研究表明用藥敏試驗的方法確定敏感藥物后再組方進(jìn)行治療，療效顯著。

近年來山西地區(qū)發(fā)生的雛雞感染沙門氏菌損失嚴(yán)重，廣大養(yǎng)殖戶缺乏必要的診斷手段，影響了治療進(jìn)程。我們旨在通過實驗室手段，進(jìn)一步明晰該病的病原情況，采取有效的用藥措施，既解決了廣大養(yǎng)殖戶的燃眉之急，也完善該病的綜合防治措施理論，從而達(dá)到減低發(fā)病或達(dá)到凈化效果，促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?被檢材料 ?15只病死雛雞均取自平定某自然發(fā)病雞場。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂、S.S.瓊脂、鮮血瓊脂培養(yǎng)基（購于杭州天和生物制品有限公司）。

1.1.3 ?主要試劑 ?沙門氏菌屬診斷血清（購于杭州天和生物制品有限公司）、微量糖發(fā)酵管及抗生素藥敏紙片（購于杭州天和生物制品有限公司）。

1.1.4 ?試驗動物 ?由平定縣某種雞場提供5日齡雛雞共120只。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細(xì)菌形態(tài)及運動力觀察 ?病料直接涂片后染色鏡檢;選取可疑菌落涂片染色、鏡檢。并對不同菌株進(jìn)行懸滴運動力檢查[7]，全部25塊病料涂片檢查，用革蘭氏染色法染色后鏡檢。

1.2.2 ?分離培養(yǎng)[8] ?無菌取肝脾組織，接種于營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂和S.S.瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況及菌落特征。將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種三糖鐵（TSI）瓊脂，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.3 ?病理組織學(xué)觀察 ?取具有眼觀病變的肝、脾、腎、心臟、卵巢及腫瘤組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，H.E染色，病理組織學(xué)檢查。

1.2.4 ?動物回歸試驗 ?用分離到的純化的病菌按107～1010稀釋后采用營養(yǎng)瓊脂平板散布法做活菌計數(shù)計算每毫升的平均活菌量，把細(xì)菌用生理鹽水稀釋成10×109cfu/ml的懸液。取60只飼養(yǎng)到5日齡的肉雛雞分為兩組，每組30只，試驗組肉雛雞口服菌液2ml/只，對照組肉雛雞口服生理鹽水2ml/只。分開飼養(yǎng)觀察發(fā)病和死亡癥狀，連續(xù)觀察7d記錄結(jié)果，取死亡雞只無菌采集心、肝、肺劃線接種于S·S瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，取典型的紅色菌落接種于營養(yǎng)瓊脂試管斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h做好標(biāo)記，放4℃冰箱保存?zhèn)溆?，再?0只5日齡的肉雛雞重復(fù)以上試驗，對比兩次試驗的結(jié)果。

1.2.5 ?生化試驗 ?取已分離純化的菌株和兩次動物回歸試驗的菌株用VITEX32全自動生化分析儀進(jìn)行分析鑒定。

1.2.6 ?平板凝集試驗 ?取這三種菌液各50μl與等量的雞沙門氏菌多價陽性血清做平板凝集試驗，呈現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。隨機抽檢100只晉中某自然發(fā)病種雞場的種雞，采集血清用標(biāo)準(zhǔn)雞沙門氏菌抗原進(jìn)行平板凝集試驗，呈現(xiàn)顆粒凝集的為陽性反應(yīng)。計算其陽性率。

1.2.7 ?藥物敏感性試驗 ?采用紙片擴散法將純培養(yǎng)分離出的6株沙門氏菌菌液，用滅菌的接種環(huán)均勻致密劃線于營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子夾取藥物紙片（杭州微生物試劑有限公司）貼在已接種的瓊脂平板培養(yǎng)基上，紙片要貼均勻，紙片與紙片中心距離不得小于24mm，每個平板上貼5張。紙片貼后不應(yīng)再移動，因為有些藥物會立即擴散。貼上紙片15min內(nèi)把平板倒置放入保溫箱37℃下培養(yǎng)16～24h，檢查藥物紙片。

用游標(biāo)卡尺測量其抑菌圈環(huán)直徑，根據(jù)藥敏試驗抑菌圈環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)來判斷細(xì)菌對藥物的敏感性。判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑≥15mm的為高敏， 10～15mm的為敏感，<10mm的為耐藥。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?形態(tài)特征和運動力 ?病料直接涂片，革蘭氏染色之后，油鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)少量革蘭氏陰性直桿菌;挑取S·S瓊脂平板上的單個菌落，涂片、火焰固定、革蘭氏染色、鏡檢可見紅色、著色均一、單個或成對的兩端渾圓的小直桿菌，無莢膜，無芽孢。符合雞沙門氏菌特征。

2.2 ?培養(yǎng)特性 ?分離菌在普通營養(yǎng)瓊脂上呈圓形、微隆起、光滑、濕潤、半透明或灰白色、邊緣整齊，直徑小于1mm的針尖大小“露珠狀”小菌落;在麥康凱瓊脂上長出無色透明，直徑有1mm的圓形小菌落;在鮮血瓊脂上不溶血;在S.S瓊脂上形成中心黑色、邊緣灰白的透明小菌落;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物呈均勻混濁，管底有少量沉淀物。三糖鐵斜面劃線培養(yǎng)，斜面上為紅色，底層穿刺培養(yǎng)，底層多數(shù)產(chǎn)生H2S為黑色，少數(shù)為黃色。

2.3 ?病理組織學(xué)觀查 ?從鏡檢肝組織內(nèi)見許多壞死灶，壞死灶內(nèi)充滿淋巴細(xì)胞、少量巨噬細(xì)胞和異嗜性白細(xì)胞，腸系膜見以淋巴細(xì)胞浸潤、結(jié)締組織增生為主肉芽腫病變，腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤、結(jié)締組織增生，胰腺細(xì)胞壞死，偶有肉芽腫病變，見圖1、圖2、圖3。

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2.4 ?動物回歸試驗 ?結(jié)果見表1。

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兩次動物回歸試驗，試驗組雞只發(fā)病癥狀及剖檢癥狀相似，同肉種雞場的病、死雞外表狀態(tài)及剖檢癥狀均一致，兩組分離的病原菌在S·S瓊脂平板上長出細(xì)小、紅色、光滑濕潤、圓形半透明大小為1mm的菌落。挑取S·S瓊脂平板上的單個菌落，涂片、革蘭氏染色、鏡檢，兩組分離的病原菌同接種的病原菌形態(tài)，大小相似。動物回歸試驗結(jié)果與實際發(fā)病情況相一致。兩組試驗的生理鹽水對照組均生長良好，沒有發(fā)病雞只。

2.5 ?生化試驗 ?結(jié)果見表2。

將供試的22個菌株經(jīng)純培養(yǎng)后分別接種于下列發(fā)酵管中觀察結(jié)果如表1。

因多數(shù)雞白痢沙門氏菌不發(fā)酵麥芽糖和衛(wèi)矛醇。可確認(rèn)S1～S14菌株屬于沙門氏菌屬D群中的雞白痢沙門氏菌;S15～S22菌株屬于沙門氏菌屬D群中的雞傷寒沙門氏菌[9]。

2.6平板凝集試驗結(jié)果 ?三株細(xì)菌與標(biāo)準(zhǔn)雞沙門氏菌多價陽性血清均發(fā)生顆粒凝集反應(yīng)，平板凝集試驗為陽性，證明這三株細(xì)菌為雞沙門氏菌。

種雞平板凝集試驗陽性率為15%，證明本種雞場雞沙門氏菌未凈化干凈。

2.7 ?藥物敏感性試驗 ?從藥敏試驗結(jié)果的整體看，所選的6株分離菌對供試的8種抗菌藥物的敏感性相似;同一血清型內(nèi)不同菌株的藥敏性表現(xiàn)基本一致，見表3。

由表3可知，6株沙門氏菌的高敏藥物有6種，分別是頭孢呋肟、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素，它們都可以作為臨床上有效的治療藥物。值得注意的是，隨著藥物在雞場使用年限的增加，沙門氏菌的耐藥程度也逐漸加強，而且出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象，這與相關(guān)報道是一致的[10]。因此對此病治療前應(yīng)做藥敏試驗。

3 ?綜合防治

3.1 ?根據(jù)藥敏試驗結(jié)果用頭孢呋肟按治療量的1.5倍飲水治療，同時水中加腎腫解毒藥及速溶性多種維生素。病雞第二天開始病情明顯改善，死亡雞只每天減少，到第7天雞只基本正常，沒有死亡雞只。

3.2 ?搞好飼養(yǎng)場的環(huán)境衛(wèi)生消毒，發(fā)病期間用1%的苯酚每日消毒一次，連續(xù)5d，以后隔日一次。

3.3 ?控制雛雞的飼養(yǎng)密度和雞舍的保溫，同時要保障通風(fēng)換氣，提高飼養(yǎng)環(huán)境質(zhì)量。

3.4 ?做好各種疫病的預(yù)防和控制，用0.5%的過氧乙酸帶雞消毒，每3d進(jìn)行一次噴霧消毒，按照防疫程序及時接種疫苗。

4 ?小結(jié)與討論

4.1 ?本病的傳染源主要為病雞和帶菌雞。傳播途徑有水平傳播和垂直傳播，本雞場雛雞沙門氏菌病的這次爆發(fā)與種母雞的雞沙門氏菌病有很重要的關(guān)聯(lián)，本種雞場雞沙門氏菌病的陽性檢出率為15%。帶菌公雞可通過精液將病原傳給母雞，母雞又可通過垂直傳播污染種蛋，所以雛雞就感染了雞沙門氏菌病，造成了很大的經(jīng)濟損失，因此對種雞的雞沙門氏菌凈化和對種蛋徹底進(jìn)行消毒，是控制該病發(fā)生的重要措施，對預(yù)防雛雞沙門氏菌尤為重要，雛雞用敏感藥物預(yù)防對本病有很好的控制作用。種雞雞沙門氏菌凈化：開產(chǎn)前一次，產(chǎn)蛋高峰一次，350日齡再檢一次，可采用快速平板凝集法全群檢疫，淘汰陽性雞只，可疑雞只隔離飼養(yǎng)，再進(jìn)行復(fù)檢，陽性者淘汰。

從該雞場采集的病死雛雞病料，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、病理組織學(xué)觀察、生化試驗、平板凝集試驗，確診為雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌兩種血清型混合感染所致。試驗結(jié)果充分說明該雞場受到雞沙門氏菌感染。利用紙片法藥敏試驗，顯示頭孢呋肟、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素對雞沙門氏菌具有高敏感性。對雞群使用頭孢呋肟1.5倍飲水治療，經(jīng)過7d的治療，雞群基本正常，無死亡雞只。

4.2 ?堅持自繁自養(yǎng)，如確需引進(jìn)，需對引進(jìn)雞場進(jìn)行雞沙門氏菌檢測咨詢，確定為無雞沙門氏菌病雞群，方可引進(jìn)。

4.3 ?對孵化種蛋進(jìn)行全出全進(jìn)制，對種蛋進(jìn)行嚴(yán)格的熏蒸消毒，每次出完雛雞以后，對孵化器進(jìn)行徹底消毒，以便殺滅環(huán)境中的細(xì)菌。

4.4 ?各種應(yīng)激因素：如飼養(yǎng)密度大、通風(fēng)不良、舍內(nèi)溫度過高或過低、衛(wèi)生條件不良、飼養(yǎng)管理不善都可誘發(fā)雞只發(fā)病，應(yīng)減少應(yīng)激因素，改善飼養(yǎng)管理，提高雛雞的營養(yǎng)水平，加強雞只抵抗力。

4.5 ?對種雞和雛雞不要亂投藥，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇敏感藥物防治雞沙門氏菌病，注意耐藥菌株的出現(xiàn)，要定期給種雞投藥，并對雞舍消毒，消除雞沙門氏菌帶菌污染，若一個種雞場雞沙門氏菌凈化后未進(jìn)行雞舍消毒，不出一個月必將導(dǎo)致雞沙門氏菌再次污染，重新檢測時雞沙門氏菌病陽性率增高。在防治沙門氏菌上，抗生素起了很大作用，但也帶來很多的負(fù)面影響。它引起消化道正常菌群失調(diào)、產(chǎn)生耐藥菌株、抑制機體的免疫反應(yīng)等，甚至給禽產(chǎn)品帶來藥物殘留。所以應(yīng)該把疾病抵御在雞場之外，最大限度地減少藥物的應(yīng)用。

4.6 ?要防止沙門氏菌病的發(fā)生，必須堅持預(yù)防第一，把沙門氏菌的檢疫放到雞場的工作程序上來，建立檢疫淘汰制度和相應(yīng)的飼養(yǎng)管理凈化措施。同時要把好引種關(guān)，從雞白痢病凈化達(dá)標(biāo)場引種。種雞場更要把好種雞檢疫關(guān)，減少垂直傳播，減弱白痢感染者隨代次的后續(xù)擴大效應(yīng)。

雞沙門氏菌對養(yǎng)雞業(yè)的危害已越來越被人們所重視，非傷寒沙門氏菌病，是人與動物腸道細(xì)菌病的主要病原[11]，目前在發(fā)達(dá)國家，沙門氏菌感染是報道最多的食源性細(xì)菌病之一[12]，雞沙門氏菌凈化工作勢在必行。

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