巴西橡膠樹葉綠體型果糖—1，6—二磷酸酶基因的全長cDNA克隆與表達(dá)分析

何斌等

摘 要 利用RACE技術(shù)從巴西橡膠樹中克隆到一個葉綠體型FBPase基因，命名為HbcpFBPase。該基因的cDNA全長為1 512 bp，包含1 209 bp的開放閱讀框，編碼一個由402個氨基酸殘基組成的蛋白，蛋白分子量大小約為43.88 ku，理論等電點(diǎn)為6.64。多重序列比對表明該基因?yàn)槿~綠體型果糖-1，6-二磷酸酶。TargetP軟件預(yù)測HbcpFBPase在葉綠體中的概率是0.961。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，HbcpFBPase基因在雌花中表達(dá)量最高，雄花及種子次之；此外，機(jī)械傷害和割膠以及多種植物激素如乙烯利ET及植物生長素2，4-D可使HbcpFBPase基因下調(diào)表達(dá)。研究結(jié)果對進(jìn)一步研究橡膠樹光合作用碳固定、以及深入研究光合作用與膠乳合成之間的關(guān)系提供理論參考。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbcpFBPase基因；克?。簧镄畔W(xué)；基因表達(dá)

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Fructose 1，6 - bisphosphatase（fructose-1，6-bisphosphatase， FBPase， EC 3.1.3.11）is a regulatory key enzyme for dark reactions of photosynthesis in green plants. In this study， the full-length cDNA of a putative chloroplast FBPase gene from Hevea brasiliensis was cloned by using rapid amplification of cDNA ends（RACE）technology， and named as HbcpFBPase. The nucleotide sequence of HbcpFBPase cDNA was 1 512 bp long， which contained an open reading frame（ORF）of 1 209 bp， and predicted a peptide of 402 amino-acids s with a molecular weight of 43.88 ku and a theoretical pI of 6.64. Multiple sequence alignment indicated that HbcpFBPase were grouped together with other known chloroplast FBPase enzymes. TargetP software predicting showed HbcpFBPase had a probability of 0.961 localized in the chloroplast. Real-time PCR analysis showed that HbcpFBPase gene was most highly expressed in the female flower， and then in male flower and seeds. Furthermore， HbcpFBPase expressions were found to be down regulated by wounding， tapping and several phytohormones（ethylene and auxin）. This study will be beneficial to further studies of rubber tree carbon fixation of photosynthesis， as well as the relationship between photosynthesis and rubber latex production.

Key words Hevea brasiliensis； HbcpFBPase； Gene cloning； Bioinformatics analysis； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.002

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料，在交通運(yùn)輸及軍用工業(yè)中都發(fā)揮著重要作用。世界上產(chǎn)膠植物有2 000余種[1]，其中99%的天然橡膠來自巴西橡膠樹[2]。與其它高等綠色植物一樣，橡膠樹利用光合作用在源組織葉片中合成蔗糖，為橡膠烴合成提供原料，因此，蔗糖的分配和利用將直接影響巴西橡膠樹的橡膠合成。

果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，F(xiàn)BPase，EC 3.1.3.11）是在綠色植物光合作用暗反應(yīng)階段起重要調(diào)控作用的關(guān)鍵酶。高等植物中存在著2種果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，F(xiàn)BPase）：胞質(zhì)型（cyFBPase）和葉綠體型（cpFBPase），分別在糖異生代謝和光合作用中起關(guān)鍵作用[3-8]。大多數(shù)高等植物中的FBPase以單聚體、二聚體和四聚體的形式存在，其中有催化活性的是四聚體形式的FBPase[9]。葉綠體和胞質(zhì)中的果糖-1，6-二磷酸酶均能被高度地調(diào)控，但調(diào)控的機(jī)制卻不同，cyFBPase在糖異生中起調(diào)控作用，受腺苷一磷酸（AMP）和果糖-1，6-二磷酸的強(qiáng)烈變構(gòu)抑制；相反的，cpFBPase在光合作用中起調(diào)控作用，對AMP和果糖-1，6-二磷酸均不敏感[10]。

光合生物固定CO2的限速步驟主要集中在光合作用暗反應(yīng)階段[11]，而其中的Calvin循環(huán)（即C3循環(huán)）是所有光合生物碳元素光合流動過程的中心環(huán)節(jié)[12]。葉綠體型果糖-1，6-二磷酸酶是Calvin循環(huán)中一個非常關(guān)鍵的酶，該酶參與產(chǎn)生二氧化碳接受體的反應(yīng)，將果糖-1，6-二磷酸不可逆的水解成果糖-6-磷酸，并且調(diào)控著Clavin循環(huán)中PO43-的循環(huán)[13-14]。FBPase的含量與同一反應(yīng)中的其他酶類相比極其微弱，但其作用卻是極為重要的[15]。

2000年，Tang等[16]克隆得到小麥cpFBPase基因，其轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到該基因的高表達(dá)；2001年，Miyagawa等[17]將藍(lán)藻葉綠體的FBPase/SBPase轉(zhuǎn)入煙草中，提高了轉(zhuǎn)基因煙草的光合能力和糖類的積累，并且加速了其植株的生長。2002年，Tine Thorbjornsen等[18]成功地分離到馬鈴薯cpFBPase基因，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化分析，與野生型的馬鈴薯塊莖相比轉(zhuǎn)化株含有更高的葉綠體FBPase活性，并且積累更多的淀粉。綜合前人的研究結(jié)果，初步表明葉綠型FBPase在源組織及庫組織的糖代謝中均發(fā)揮重要調(diào)控作用。此外，Xiao等[19]最近研究結(jié)果表明，cpFBPase在如高溫、干旱等非生物脅迫下也起著重要的作用。

本研究首次從巴西橡膠樹中分離并獲得一個葉綠體型FBPase基因，利用生物信息學(xué)平臺分析該基因的結(jié)構(gòu)功能，并采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析該基因的表達(dá)模式。解析HbcpFBPase基因的結(jié)構(gòu)和功能，研究HbcpFBPase基因的表達(dá)模式，有助于初步揭示橡膠樹葉綠體型FBPase在光合作用以及在糖代謝過程中的調(diào)控機(jī)理，為進(jìn)一步研究橡膠樹光合作用、膠乳糖代謝提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為熱研7-33-97橡膠樹無性系，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場三隊(duì)。

1.1.2 載體與菌株 克隆載體pMDR18-T Simple Vector購自大連寶生物公司（TaKaRa），Escherichia coli JM109菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 藥品與試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Stand cDNA Systhesis Kit為Fermentas公司產(chǎn)品；TransTaq DNA Polymerase HiFi Fidelity（HiFi）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒Gel Extraction Kit為OMEGA公司產(chǎn)品；實(shí)時熒光定量PCR試劑SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）為大連寶生物公司（TaKaRa）產(chǎn)品；引物合成和測序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司（Introvigen）完成；其它生化試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑，購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物材料處理 同一處理的試驗(yàn)用橡膠樹均在相同林段中，膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花等組織來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場三隊(duì)的熱研7-33-97品系，其中膠乳的具體采集方法參照Tang等[20]方法進(jìn)行。

不同發(fā)育時期葉片選用同一林段的未開割橡膠樹，按照葉芽、古銅期、變色期、淡綠期、穩(wěn)定期和衰老期，分別選取15株；每5株采取后的樣品混在一起作為一個重復(fù)，共3個重復(fù)。

激素處理選用已開割3 a的巴西橡膠樹，在采膠前3、12、24 h分別將乙烯利（ET，1.5%）、茉莉酸（JA，0.005%）、脫落酸（ABA，200 μmol/L）、細(xì)胞分裂素（CTK，200 μmol/L）、赤霉素（GA，100 μmol/L）、水楊酸（SA，200 μmol/L）及植物生長素（2，4-D，66 μmol/L）涂于割線及其上部約2 cm的割面，以0 h為對照，于同一時間采集膠乳[20-21]。

傷害和割膠處理均選用樹齡8 a且已達(dá)到開割標(biāo)準(zhǔn)的未開割橡膠樹，具體處理方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

死皮樹材料選取輕度死皮（死皮率<30%），中度死皮（30%～60%）和嚴(yán)重死皮（60%～90%）3種情況，以健康樹為對照，于同一時間采集膠乳。

1.2.2 膠乳總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

橡膠樹膠乳總RNA的提取采用本實(shí)驗(yàn)室改良的提取方法[24]，其他組織RNA提取參照Kiefer等[23]提取方法進(jìn)行，cDNA第一條鏈合成使用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 HbcpFBPase基因全長cDNA的克隆 結(jié)合NCBI上搜索得到的白楊樹（XP_002323933.2）以及蓖麻（XM_002532720.1）的果糖-1，6-二磷酸酶（FBPase）的核苷酸序列，搜索本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，得到一條拼接序列。以此設(shè)計特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增（見表1），并利用cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE），最終獲得包含完整讀碼框的cDNA全長序列。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得目的片段，回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 HbcpFBPase基因核苷酸翻譯及多序列比對使用DNAMAN7.0軟件；采用ExPASy服務(wù)系統(tǒng)中的ProtParam工具對蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）；通過NCBI的在線軟件CDD（conserved domain database）對該基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；亞細(xì)胞定位采用TargetP預(yù)測http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/；其他物種的氨基酸序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫，使用MEGA5.05軟件，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行聚類分析，進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR分析 利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析HbcpFBPase基因在不同組織，以及割膠、傷害、不同激素等各種處理下的表達(dá)模式，采用大連寶生物公司（TaKaRa）的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time），使用羅氏公司LightCycler2.0實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)。根據(jù)克隆得到的HbcpFBPase基因cDNA全長序列設(shè)計引物HbcpFBPase-Q-F、HbcpFBPase-Q-R（表1），使用YLS8（yellow leaf-specific protein 8）[20]作為內(nèi)參基因（表1），每個樣品設(shè)3個重復(fù)，分析HbcpFBPase基因的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbcpFBPase基因的克隆與序列分析

根據(jù)蓖麻和楊樹FBPase基因的核苷酸序列，在橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，拼接得到一條1 200 bp的核苷酸序列。設(shè)計特異引物，以橡膠樹cDNA為模板獲得一條1 146 bp的核苷酸序列，再采用5′RACE技術(shù)后，最終獲得包含完整讀碼框的cDNA全長序列。序列分析發(fā)現(xiàn)該片段為橡膠樹FBPase基因的cDNA全長序列1 513 bp，ORF Finder軟件分析結(jié)果顯示，該序列包含233 bp的5′非編碼區(qū)（5′UTR），71 bp的3′非編碼區(qū)（3′UTR），以及長度為1 209 bp的開放閱讀框（ORF）（圖1）。

2.2 HbcpFBPase基因生物信息學(xué)分析

采用ProtParam tool軟件預(yù)測該基因編碼了一個由402個氨基酸殘基組成的蛋白，蛋白分子量大小約為43.88 ku；氨基酸組成分析結(jié)果顯示，該蛋白富含絲氨酸Ser（10.2%），甘氨酸Gly（9.5%）和異亮氨酸Leu（9.0%），而半胱氨酸Cys（0.7%）和色氨酸Trp（0.5%）含量較低。該蛋白理論等電點(diǎn)（PI）為6.64，不穩(wěn)定系數(shù)為（Instability index）42.32，說明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。

NCBI在線軟件CDD（conserved domain database）分析結(jié)果顯示，該蛋白含有果糖-1，6-二磷酸酶保守結(jié)構(gòu)域（FBPase，F(xiàn)ructose-1，6-bisphosphatase，cd00354）。Blast比對結(jié)果表明，該蛋白氨基酸序列與蓖麻（Ricinus communis，XP_002532766），毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002323933.2），葡萄（Vitis vinifera，XP_002270826），可可（Theobroma cacao，XP_007042824.1）的葉綠體型FBPase氨基酸序列同源性分別達(dá)到了82%、81%、75%、75%（圖2星號所示為活性位點(diǎn)）。用TargetP軟件亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，HbcpFBPase在葉綠體中的概率為0.961，因此綜合推測該蛋白為橡膠樹葉綠體型果糖-1，6-二磷酸酶，命名為HbcpFBPase。

2.3 氨基酸序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

為了進(jìn)一步比較橡膠樹和其他植物果糖-1，6-二磷酸酶基因在進(jìn)化上的相互關(guān)系，選取蓖麻（Ricinus communis）、可可（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、黃瓜（Cucumis sativus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、薺菜（Capsella rubella）、大豆（Glycine max）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）、小米（Setaria italica）、苜蓿（Medicago truncatula）16個物種，搜索其FBPase蛋白氨基酸序列17條，利用Mega5.05軟件，采用Neighbor-Joining，進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，17條FBPase蛋白序列被分為兩類，即I類雙子葉植物，其中包括本次研究的橡膠樹和雙子葉模式生物擬南芥；II類單子葉植物，其中包括水稻、玉米等典型的單子葉植物。HbcpFBPase與其他物種FBPase的蛋白序列同源性均較高，這也說明該基因在進(jìn)化過程中相對保守。

2.4 HbcpFBPase表達(dá)分析

2.4.1 HbcpFBPase基因的組織特異表達(dá)模式分析

采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析HbcpFBPase基因在橡膠樹不同組織中的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，該基因在橡膠樹雌花、雄花、種子、根、樹皮、葉片及膠乳中均有表達(dá)，其中在雌花中的表達(dá)豐度最高；其次在雄花、種子、根及樹皮中的表達(dá)次之；膠乳中表達(dá)豐度最低（圖4）。

2.4.2 HbcpFBPase基因在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析 在橡膠樹葉片芽期到穩(wěn)定期的發(fā)育過程中，HbcpFBPase基因表達(dá)豐度變化不大，在衰老期其表達(dá)量達(dá)到峰值（圖5）。

2.4.3 HbcpFBPase在不同激素處理下的表達(dá)模式分析 分析7種不同激素（乙烯利ET、茉莉酸JA、脫落酸ABA、細(xì)胞分裂素CTK、赤霉素GA、水楊酸SA及植物生長素2，4-D）對該基因在膠乳中表達(dá)調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)乙烯利ET和植物生長素2，4-D處理后該基因下調(diào)表達(dá)，且均在處理24 h表達(dá)量降至最低；脫落酸ABA和水楊酸SA處理后，其表達(dá)量有緩慢上升的趨勢；赤霉素GA處理則呈現(xiàn)先下調(diào)，后在24 h時上調(diào)至0 h對照的表達(dá)水平；而茉莉酸JA、細(xì)胞分裂素CTK則對HbcpFBPase基因的表達(dá)無明顯影響（圖6）。

2.4.4 HbcpFBPase在割膠及傷害處理下的表達(dá)模式分析 分析HbcpFBPase基因在割膠及傷害處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，傷害處理使膠乳中HbcpFBPase基因明顯下調(diào)表達(dá)，在處理12 h表達(dá)量降到最低，這一點(diǎn)和乙烯利刺激后變化趨勢相似，可能是因?yàn)閭μ幚砗髸a(chǎn)生乙烯有關(guān)；在未開割樹中，割膠明顯影響膠乳中HbcpFBPase基因的表達(dá)，與第一刀的表達(dá)水平相比，第二刀中HbcpFBPase基因略有上調(diào)，但此后直到第6刀明顯下調(diào)表達(dá)，且在第6刀后一直保持低水平表達(dá)（圖7）。

在不同死皮程度橡膠樹的膠乳中，HbcpFBPase基因的表達(dá)模式與死皮程度沒有明顯的關(guān)聯(lián)。

3 討論與結(jié)論

葉綠體型果糖-1，6-二磷酸酶是植物Calvin循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，其參與CO2接受體再生的反應(yīng)，催化果糖-1，6-二磷酸生成果糖-6-磷酸，并且也參與在葉綠體中淀粉的合成[25]。在高等植物中，原初同化產(chǎn)物一部分以三碳糖的形式被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中用于蔗糖的合成及其它代謝，另一部分則留在葉綠體中轉(zhuǎn)化為淀粉，cpFBPase催化產(chǎn)物果糖-6-磷酸是代謝物從卡爾文循環(huán)進(jìn)入淀粉合成過程中的分支點(diǎn)。因此，cpFBPase也許在調(diào)節(jié)蔗糖和淀粉的碳分配中起著重要作用[26-30]。

在巴西橡膠樹中，蔗糖是合成天然橡膠的主要原料，源組織葉片光合作用合成蔗糖的能力，以及乳管中蔗糖的代謝水平均影響橡膠樹的產(chǎn)膠能力，因此蔗糖的合成和供給與橡膠樹的產(chǎn)量密切相關(guān)[31-33]。本研究首次從橡膠樹中分離并獲得一個葉綠體型果糖-1，6-二磷酸酶基因，實(shí)時熒光定量PCR分析表明，HbcpFBPase基因在分析的7種組織中均有表達(dá)，其中在雌花中表達(dá)量最高，雄花及種子次之，此前也有研究者以油茶“湘林 1 號”的近成熟種子為材料，在庫組織中克隆獲得油茶cpFBPase基因[15]；且該基因在庫組織膠乳中的表達(dá)受割膠和傷害影響，推測其不僅僅只作用于光合作用暗反應(yīng)階段，可能也與cyFBPase一樣通過糖代謝的方式參與橡膠樹膠乳再生過程[34]。在所進(jìn)行的7種激素（乙烯利ET、茉莉酸JA、脫落酸ABA、細(xì)胞分裂素CTK、赤霉素GA、水楊酸SA及植物生長素2，4-D）處理中，ET能明顯下調(diào)HbcpFBPase的表達(dá)，在處理12 h后的mRNA表達(dá)量降低到對照的一半左右（圖5），推斷該基因啟動子中可能含有受乙烯利誘導(dǎo)的順式調(diào)控元件，但其受乙烯利調(diào)控的分子機(jī)制和生理學(xué)意義還需進(jìn)一步驗(yàn)證[35]。在ABA、GA、SA及2，4-D處理后，該基因的表達(dá)量略有變化，但并不明顯；而在JA和CTK處理下，表達(dá)量幾乎不受影響。除此之外，本研究分析了該基因在不同發(fā)育時期葉片中的表達(dá)模式，結(jié)果表明HbcpFBPase基因與葉片發(fā)育進(jìn)程關(guān)系不大，推測其可能直接影響光合作用效率及碳水化合物的積累[17]。

本研究結(jié)果初步表明，橡膠樹cpFBPase在庫組織膠乳糖代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步研究其在膠乳糖代謝中的調(diào)控能力，從而為揭示橡膠樹產(chǎn)膠機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)。同時，本實(shí)驗(yàn)尚未涉及到光合作相關(guān)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)研究將關(guān)注該基因在光合作用碳固定中的調(diào)控能力。

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